弓形虫（Toxoplasma gondii）属于顶复门原虫,宿主广泛,呈世界性分布,严重危害人类健康和畜牧业的发展。弓形虫在入侵宿主细胞过程中会形成纳虫泡膜（parasitophorous vacuole member,PVM）,同时招募宿主细胞中的线粒体和内质网;利用宿主细胞中的营养物质作为能量底物,维持自身生长发育并促进自身运动,并为新生速殖子的发育提供必要的营养。脂肪酸是弓形虫纳虫泡（parasitophorous vacuole,PV）和细胞器的主要成分,脂肪酸的代谢对弓形虫生存和复制过程起着十分重要的作用。但目前对弓形虫脂肪酸代谢过程的研究还十分有限,对脂肪酸生物合成过程中的关键基因的功能解析仍不全面。本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对II型脂肪酸合成途径（FASⅡ途径）的四个基因[beta-hydroxyacyl-acyl carrier protein dehydratase（FabZ）、3-oxoacyl-acyl-carrier protein synthase I/II（FabB/F）、3-oxoacyl-（acyl-carrier-protein）reductase（ODSCI）和3-oxoacyl-（acyl-carrier-protein）reductase（ODSCII）]进行了生物学功能探究。FASⅡ途径是顶复门原虫所特有且十分重要的途径,鉴于对FASⅡ途径相关基因在弓形虫生长发育中所起的作用还了解的较少,本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在两个弓形虫虫株（I型RH虫株和II型PRU虫株）上构建了针对四个基因（FabZ、FabB/F、ODSCI和ODSCII）的敲除虫株。通过免疫荧光实验和定量PCR（q PCR）分析,我们发现:与野生（wide type,WT）株相比,RHΔFabZ和RHΔFabB/F株的顶质体发生部分丢失,且顶质体基因组DNA的含量显著降低,这表明FabZ和FabB/F对于弓形虫顶质体的完整性和基因组的维持具有重要作用。空斑实验、复制实验结果显示,RHΔFabZ和RHΔFabB/F株的体外生长能力受到明显抑制,而RHΔODSCI和RHΔODSCII株则未检测到类似的变化。与RHΔODSCI和RHΔODSCII相比,RHΔFabZ和RHΔFabB/F对小鼠的毒力降低,存活率提高。与PRUΔODSCI和PRUΔODSCII相比,PRUΔFabZ和PRUΔFabB/F显著减少了小鼠脑包囊的数量。这些结果表明FabZ和FabB/F对弓形虫的生长发育和致病力具有重要作用,而ODSCI和ODSCII对这些特性没有贡献。通过WT株和缺失株之间的表型差异,我们推测缺失FabZ、FabB/F基因对RH虫株基因表达谱会有影响,因此我们对RH WT和RHΔFabZ、RHΔFabB/F进行了转录组测序分析。与WT相比,在FabB/F缺失株共鉴定到1994个差异表达基因,其中1156个基因表达上调,838个基因表达下调;在FabZ缺失株共鉴定到1846个差异表达基因,其中1210个基因表达上调,636个基因表达下调。进一步对差异表达基因分析发现,共有8个基因在RHΔFabZ和RHΔFabB/F中同时发生了上调,且这些基因都参与了FASⅡ途径;共有9个基因同时发生了下调,以AP2结构域转录因子为主。通过对差异表达基因进行GO和KEGG分析发现,它们主要涉及脂质代谢、细胞生物合成、酶活性过程以及氨基糖和核苷酸糖代谢和次级代谢产物的合成通路,这说明当弓形虫的FabZ、FabB/F被敲除后,弓形虫通过这些差异表达基因参与的代谢和合成过程为自身提供能量和营养物质以维持自身生长发育。利用GC-MS和同位素标记技术对RH WT株和RHΔFabB/F缺失株的脂肪酸含量进行了分析,与WT株相比,ΔFabB/F缺失株的肉豆蔻酸（C14:0）和棕榈酸（C16:0）的含量显著降低;C14:0和C16:0的同位素图谱显示,在WT株中有大量的M8-M14/16同位素异构体(对应于13C标记的8-14/16个碳);而在ΔFabB/F缺失株中,它们大多位于M0组分(即没有13C标记)。这些结果表明FabB/F在13C进入中链脂肪酸的流量中发挥了重要作用。综上所述,本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术、转录组和代谢组分析等技术,评价了参与FASⅡ途径的FabZ、FabB/F、ODSCI和ODSCII基因对弓形虫（RH株和PRU株）发育过程及致病力的影响,发现FabZ和FabB/F对弓形虫的生长发育和毒力具有重要作用;差异表达基因主要参与脂质代谢、细胞生物合成、酶活性过程、氨基糖和核苷酸糖代谢和次级代谢产物的合成通路,说明缺失株生长减慢、毒力减弱等现象正是由于上调或下调基因发挥作用以支撑其继续生长;13C-glucose同位素标记实验发现FabB/F的缺失导致弓形虫脂肪酸合成受阻,研究结果为进一步阐明弓形虫的脂肪酸代谢机制奠定了基础。