花生是重要的油料作物和经济作物,在抗除草剂方面的研究与水稻、玉米和大豆等作物相比,较为匮乏,因此亟需对其种质资源进行改良和创新。本实验室在前期获得了一个对唑嘧磺草胺和双氟磺草胺除草剂均具有超强耐性的花生突变体材料,对其非靶标抗性形成的分子机制进行了初步解析。在RNA-seq技术的分析下,获得了37个尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因（Uridine diphosphate glucosyltransferase,UGT）。有研究报道糖基转移酶在解除内外源毒素方面起到关键作用,为了明确糖基转移酶基因在突变体非靶标抗性形成中的具体作用,本研究筛选了差异表达变化较大的3个尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因（ENIS4M、E3VS3U和WIN7QF）,拟通过生物信息学与分子生物学的相关手段对其耐双氟磺草胺除草剂进行作用分析。具体研究结果如下:1.为了验证M8花生突变体耐除草剂的稳定性,我们分别在田间和实验室条件下对其进行试验。首先,在田间利用叶面喷施法(33.2 mg.L-1,除草剂浓度为大田4倍)对幼苗期花生进行处理。表型调查显示:突变体株系H2-24-33和H2-5-1-22在株高、果荚数和侧根数农艺性状方面优于野生型‘山花15’;生理调查显示:除草剂胁迫下,与野生型‘山花15’相比,突变体株系H2-24-33和H2-5-1-22的SOD、POD和CAT酶活在不同时间均有所上升。其次,在实验室条件下利用浸种法(8.3 mg.L-1,除草剂浓度为大田1倍)处理,发现突变体的出苗率是野生型的2倍;同时,突变体株系H2-24-33和H2-5-1-22的根系生长均保持正常,主根伸长且有大量侧根,而野生型只有个别长出主根。2.糖基转移酶是一类重要的多功能超家族酶,我们运用生物信息学对3个UGTs基因进行分析。结果显示它们编码的氨基酸长度、等电点与分子量差异较小,都属于亲水性酸性蛋白,无信号肽和跨膜结构域,定位于细胞质内。二级结构预测显示它们编码的蛋白仅包含α-螺旋、β-折叠和随意卷曲;三级结构显示ENIS4M和WIN7QF基因编码的蛋白属于GT-A类型,而E3VS3U基因编码的蛋白属于GT-B类型。此外,进化关系显示3个基因分别属于栽培花生UGT家族的L、D和I亚家族,而顺式作用元件预测下显示含有较多与光、激素及胁迫相关的元件。q RT-PCR技术显示3个UGTs基因对双氟磺草胺均有响应,且在24 h时突变体中的表达量都低于野生型,这与转录组的趋势一致。此外,它们在野生型和突变体花生中的时空表达特性显示,在不同时期的叶、花和根的表达量均较高,而无论是在幼苗期还是开花期的茎以及种子,表达量均较低。3.进一步探究3个UGTs基因在解毒代谢途径中所发挥的功能,我们在模式植物拟南芥中对其进行异源表达。首先将3个基因克隆到含有35S启动子的植物双元表达载体中,然后采用农杆菌介导的花序侵染法将UGTs导入野生型拟南芥中,最后用抗生素筛选得到纯合单插入位点的目标基因转基因株系。对这些株系进行除草剂抗性调查,结果表明:低浓度双氟磺草胺除草剂处理下,转基因植株在幼苗期,子叶白化率显著低于野生型和空载;高浓度处理下,转基因株系植株在营养生长期,地上部叶片的失绿程度略微低于野生型和空载。上述结果揭示了3个UGTs基因编码蛋白的理化性质、二/三级结构和进化关系方面存在的差异,及其对除草剂的响应和时空表达特性。它们在拟南芥中的异源表达不同程度地增强了植株对除草剂的耐受性,有助于进一步完善人们对除草剂非靶点抗性机制的认知。