支链氨基酸（BCAAs）中包括L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸,这三种氨基酸合成途径中需要八种酶的参与,本论文主要针对BCAAs生物合成途径中第一个共用酶—乙酰羟酸合酶（AHAS）,又称乙酰乳酸合酶（ALS）进行研究讨论。分别以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC6633和枯草芽孢杆菌168基因组中编码ALS蛋白的基因为模板,通过实验获得重组质粒p ET-28a-BsALS6633以及p ET-28a-BsALS168,在此基础上转化工程菌并表达后得到BsALS168蛋白浓度为5.4 mg/m L、BsALS6633蛋白浓度为3.2 mg/m L。利用乙偶姻标准曲线测定得到BsALS168催化反应使得90.6%的底物丙酮酸进行转化;BsALS6633催化反应使得82.4%的底物丙酮酸参与反应。结果显示,通过实验得到了活性、浓度均良好的BsALS6633和BsALS168蛋白,为后续实验的顺利进行打下了坚实的基础。利用BsALS6633催化以一分子丙酮酸和一分子苯甲醛为底物的反应,目的在于得到中药麻黄碱的合成前体物质苯基乙酰基甲醇（PAC）。实验证实BsALS6633具有催化生成PAC的能力,气相色谱检测确定产物构型为R型;经反应条件优化后,以制备高效液相色谱法分离纯化得到R-PAC的产率可提升至89.1%。优化后条件为:反应最佳时间为60 min,反应体系酸度为p H=7,底物最佳浓度比为丙酮酸:苯甲醛=1.2:1（12 m M:10 m M）,助溶剂DMSO的含量为2%-3%。同时,实验针对不同来源的ALS和AHAS进行底物偏好性的探究,包括BsALS、大肠杆菌AHAS、枯草芽孢杆菌AHAS、酿酒酵母AHAS、结核分枝杆菌AHAS等。当底物丙酮酸、丁酮酸和苯甲醛同时存在时,对其底物的偏好性进行详细的研究,对比不同AHAS/ALS在底物偏好性上的异同。反应结果显示,大肠杆菌AHAS、Bs AHAS、酿酒酵母AHAS在催化以丙酮酸、2-丁酮酸和苯甲醛作为底物的反应时,R-PAC的产量均明显降低,分析原因是由于受到体系中2-丁酮酸的影响,使得丙酮酸更倾向于与2-丁酮酸进行反应而并非苯甲醛,造成R-PAC产量降低;结核分枝杆菌AHAS催化反应结果显示,反应后体系中R-PAC含量很少,低于R-PAC标准曲线的最低检测线,分析原因是由于2-丁酮酸的加入,使得丙酮酸几乎不与苯甲醛结合生成R-PAC,R-PAC的生成存在明显的底物抑制作用。对BsALS168基础酶学性质的研究表明,该酶催化反应最适温度为37℃,最适p H为7.0;同时,该酶展现出对有机溶剂甲醇和助溶剂DMSO的强耐受性,当甲醇含量达到50%时,该酶仍能保留50%的活性,当DMSO含量达到50%时,该酶仍能保留80%的活性。与其他细菌源的ALS相比,该酶具有对有机溶剂和助溶剂的强耐受性。利用柱前衍生-HPLC法直接对底物丙酮酸进行测定,BsALS168催化单底物丙酮酸的稳态动力学参数测定结果显示KmPyr=6.61 m M,Vmax=23.31 mmol/min。实验通过柱前衍生-HPLC法,进一步探究了BsALS168催化单底物反应、双底物反应时的产物分布及产物产率。结果显示,该酶更倾向于催化其天然底物丙酮酸的反应,其次是催化以丙酮酸作为供体底物以2-丁酮酸作为受体底物的反应,再者是以2-丁酮酸作为供体底物以丙酮酸作为受体底物的反应,最后才是以2-丁酮酸作为单底物的反应。BsALS168在催化反应过程中可将底物丙酮酸脱羧生成乙醛,将底物2-丁酮酸脱羧生成丙醛,发挥出类似α-酮酸脱羧酶的作用,例如当底物丙酮酸:2-丁酮酸=5 m M:5 m M时,乙醛产率为24.4%,丙醛产率为43.36%。同时实验通过改变底物丙酮酸和2-丁酮酸的比例,对不同底物比例下所得产物的分布及产率进行探究,对BsALS168的底物偏好性有了更深入的认识。