美味牛肝菌多糖高产菌株的选育及其发酵工艺研究

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美味牛肝菌属外生菌根菌,其多糖具有明显的抗肿瘤效果。为了选育出美味牛肝菌多糖高产菌株,本实验首次采用原生质体紫外线-氯化锂(UV-LiCl)复合诱变方法,并对诱变株(UL-7)发酵工艺进行了研究。本实验主要研究结果如下:1、首先摸索出美味牛肝菌出发菌株ACCC50559快速生长的斜面培养基,并优化出美味牛肝菌多糖的提取工艺和含量测定方法。在此基础之上,进行了出发菌株ACCC50559原生质体UV-LiCl复合诱变选育多糖高产菌株的研究,确定了原生质体制备和复合诱变的最佳条件。原生质体制备最佳条件为:培养52h的菌丝用0.02g/mL纤维素酶和0.02g/mL蜗牛酶(体积比1:1)混合酶液酶解,以0.6mol/L的甘露醇作为稳渗剂,在25~29℃下酶解2h,原生质体的数目可达3.50×106个/mL,其再生率为7.14%;原生质体UV-LiCl复合诱变的最佳条件为:距15W紫外灯30cm处,照射原生质体6min,然后涂布在0.04%LiCl平板上,避光培养10d,致死率达到79.6%。对诱变菌株进行平板培养和发酵试验,通过初筛和复筛最终选育出遗传性状稳定的多糖高产菌株(UL-7),其菌落密度和菌丝生长长势较出发菌株要密和粗壮,生长速度快,产量为3.972g.L-1,较出发菌株提高了41.9%;2、优化出诱变株UL-7液体发酵的最佳工艺条件。液体发酵产多糖的最适培养基配方(%):蔗糖2,蛋白胨0.6,ZnSO4·7H2O 0.10,CaCO3 0.1, MgSO4·7H2O 0.2, KH2PO4 0.3,马铃薯10;液体发酵产多糖的最适发酵条件:初始pH 5.0~5.4,振荡速度120r/min,培养温度25℃~28℃,装液系数40%(v/v),加玻璃珠10颗,发酵时间5d,多糖产量可达到4.361g/L;3、在诱变株UL-7最佳液体发酵条件基础上,首次探索出其高密度发酵高产多糖的工艺:接种生物量40g/L,初始pH5.4,培养温度25℃,装液系数40%(v/v),振荡速度160r/min,蛋白胨增加到1.8%,碳氮比(C/N)为6:1,羧甲基纤维素(CMC)浓度为0.5%,维生素B1浓度为40mg/L,三十烷醇的最佳用量为0.8×10-6mg/L,发酵时间5d,多糖产量可达到9.840g/L。通过10L机械搅拌罐放大培养,发酵时间缩短为96h,多糖产量高达9.930g/L。
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