肝内胆管细胞癌是一种起源于肝内胆管上皮细胞的原发性腺癌,其发病率在原发性肝癌中次于肝细胞肝癌,居第二位。目前手术切除是治疗肝内胆管细胞癌的主要手段,患者的预后在过去十年内并没有得到很大提高,主要原因是由于肝内胆管细胞癌手术切除率低,同时术后高转移复发率影响患者长期生存。所以,探索肝内胆管细胞癌发生以及转移复发中的关键分子,对于改善它的预后有着重要意义。DKK1是一种分泌性蛋白,最早发现于胚胎发育过程。随后,大量实验证实其在肿瘤的发生发展中起重要作用,并可以作为预测预后的指标。其在血清中的表达,也在部分肿瘤中被证实有诊断学意义。复旦大学肝癌研究所(以下简称“我所”)先前的实验证实了DKK1在肝细胞肝癌的侵袭与复发中起重要作用,且可以成为独立的预测预后指标。本研究检测了DKK1在肝内胆管细胞癌患者肿瘤组织及血清,肝内胆管细胞癌细胞系中的表达,使用siRNA干扰的方法,在肝内胆管细胞癌细胞系上敲除DKK1的表达,观察其与肿瘤侵袭,迁移和增殖的关系。在138例标本的组织芯片上检测DKK1的表达,分析其与临床病理特征的关系及预后价值,对DKK1在肝内胆管细胞癌的侵袭与转移中的作用做初步探讨。第一部分分泌型蛋白DKK1在肝内胆管细胞癌中的过表达目的：研究DKK1在肝内胆管细胞癌、相应癌旁,肝内胆管细胞癌细胞系及肝内胆管上皮细胞系中的表达差异,分析其与肝内胆管细胞癌发生的关系。方法：应用qRT-PCR、western blot, ELISA、免疫荧光与免疫组织化学方法检测分泌型蛋白DKK1在肝内胆管癌细胞系HCCC-9810和人肝内胆管上皮细胞系IBEpiC中及其上清液中、肝内胆管细胞癌患者癌组织、相应癌旁组织和血清中的表达情况。结果：qRT-PCR、western blot及免疫荧光结果表明DKK1在肝内胆管细胞癌细胞株中的表达要比正常人肝内胆管上皮细胞株的表达要明显增高。ELISA法显示在肝内胆管细胞癌细胞株上清液中DKK1明显升高(p<0.05)。DKK1在肝内胆管细胞癌患者癌组织中的表达量比相应癌旁中的表达量高,两者间差异具有显著性(p<0.05)。在早期复发的患者中DKK1表达明显上调(p<0.05)。结论：分泌型蛋白DKK1在肝内胆管细胞癌中高表达,其可能在肿瘤发生中有重要作用。第二部分DKK1在肝内胆管细胞癌中的诊断与预后价值及其与临床病理特征的关系目的：研究DKK1在肝内胆管细胞癌中的表达,探讨DKK1与肝内胆管细胞癌临床病理学特征的关系及其预后意义。方法：应用免疫组化的方法,检测138例患者肝内胆管细胞癌组织芯片的DKK1表达,SSPS19.0统计分析两者与肝癌临床病理特征及预后的关系。结果：DKK1蛋白的高表达与肝内胆管细胞癌患者的肝门淋巴结转移有关p<0.05)。DKK1+组的术后3、5年生存率明显低于DKK1-组p<0.05)；多因素生存分析显示DKK1表达是患者总体生存率和无瘤生存率的独立预后因子；且在早期肝内胆管细胞癌患者中仍有预后价值；联合血清CEA可以提高DKK1的预测预后的效用。结论：DKK1与肝内胆管细胞癌的淋巴结侵袭与转移相关,且与预后有关。第三部分下调DKK1表达与肝内胆管细胞癌细胞侵袭与转移的影响目的：研究分泌型蛋白DKK1与肝内胆管细胞癌细胞侵袭与转移的关系。方法：采用小RNA干扰的方法,经western blot,qRT-PCR, ELISA验证DKK1在肝内胆管细胞癌细胞株HCCC-9810表达下调后,CCK8检测细胞增殖能力变化；transwell试验研究细胞侵袭能力变化。划痕实验研究细胞迁移能力变化。结果：siRNA干扰后细胞株DKK1表达下调明显；DKK1干扰组细胞的迁移与侵袭能力明显减弱。肝内胆管细胞癌细胞增殖受DKK1表达水平影响较小(p>0.05)；结论：分泌型蛋白DKK1与肝内胆管细胞癌的侵袭与迁移正相关。第四部分DKK1介导VEGF-C与MMP-9促进肝内胆管细胞癌淋巴结转移的研究目的：研究DKK1通过VEGF-C及MMP9的作用与肝内胆管细胞癌的淋巴结转移的关系。方法：用qRT-PCR的方法,研究13例肝内胆管细胞癌组织中DKK1与VEGF-C及MMP9在mRNA水平上的关系。用免疫组化的方法研究138例肝内胆管细胞癌患者组织芯片中DKK1与VEGF-C及MMP9的表达关系。用siRNA干扰技术,在肝内胆管细胞癌细胞系中下调DKK1的表达,观察VEGF-C及MMP9的相应表达变化。结果：在新鲜组织及组织芯片上,DKK1与VEGF-C及MMP9的表达均有相关性(p<0.05),siRNA干扰DKK1表达后,肝内胆管细胞癌细胞的VEGF-C及MMP9的表达明显减低(p<0.05)。结论：DKK1可能通过调节VEGF-C及MMP9促进肝内胆管细胞癌的淋巴结转移。