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电压门控质子通道广泛存在于多种细胞与组织中,在生物体的生命活动中发挥了重要的生理功能。尤其是在免疫系统中,电压门控质子通道发挥了关键作用。而人电压门控质子通道Hv1于2006年才从分子水平上得到确定,因此其功能方面的研究仍存在许多未知。本文用基因重组,克隆的方法构建出Hv1的表达载体,并通过原核系统表达纯化出Hv1蛋白,然后用纯化的蛋白制备多克隆抗体。继而通过免疫染色,免疫荧光的方法检测其在大鼠脑缺血,人乳腺癌等组织中的表达情况。通过受损的组织检测,初步研究其在免疫系统中的作用。
目的:
1.表达纯化出Hv1蛋白。
2.用纯化的蛋白制备出小鼠抗Hv1的多克隆抗体。
3.通过抗体检测Hv1在组织中的表达情况。
方法:
1.构建原核表达载体,并经酶切证实。IPTG诱导表达Hv1融合蛋白,将重组基因工程菌扩大诱导表达,用GST特异结合方法,分离纯化蛋白。
2.将纯化的蛋白与弗氏佐剂乳化,将其作为抗原免疫BALB/c小鼠,免疫四次,每次免疫间隔10天,获得小鼠抗Hv1的多克隆抗体,并通过间接ELISA检测多克隆抗体效价。
3.建立SD大鼠的脑缺血模型,收集得到乳腺癌组织,制作SD大鼠大脑的冰冻切片,乳腺癌组织的石蜡切片。用免疫荧光的方法检测其在脑缺血中的表达情况,同时进行正常脑的免疫荧光实验,与脑缺血进行对比。通过双染的方法检测Hv1在脑缺血情况下的小胶质细胞,星形胶质细胞,和神经元的表达情况。用免疫组化的方法检测Hv1在乳腺癌组织,正常乳腺组织,和乳腺增生组织中的表达情况。
结果:
1.成功构建Hv1蛋白表达载体,DNA电泳检测表明构建出Hv1的原核表达载体。
2.表达并纯化出Hv1蛋白,并通过SDS—PAGE验证所表达的蛋白为目的蛋白。纯度高于99％。
3.得到小鼠抗Hv1的多克隆抗体,抗体效价高于1:100000。
4.Hv1在大脑缺血的情况下大量表达,而在正常的脑组织中少量存在。
5.Hv1在大脑神经元,星形胶质细胞,小胶质细胞均有表达。
6.Hv1在乳腺癌组织中大量表达,而在正常的乳腺组织和乳腺增生的组织中没有表达。