猪繁殖与呼吸综合征（Porcinc reproductivc and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍，仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRSV对猪肺泡巨噬细胞有严格嗜性，抗原性极易发生变异，以至于出现了目前流行的变异株。目前用于预防PRRS的疫苗主要是传统的弱毒苗和灭活苗，但已证实弱毒苗存在散毒及高几率毒力返强的安全隐患，许多国家已经禁止使用弱毒苗；灭活苗安全性虽好，但需多次接种，而且免疫效果不确实，还经常导致免疫失败。因此，研究安全、高效、廉价的新型疫苗来防制PRRS具有十分重要的意义。改良型痘苗病毒安卡拉株（Modifed vaccinia virus ankara，MVA）被认为是最具潜力的病毒载体之一，重组MVA能够模仿体內病毒感染的过程，向机体的免疫系统提供“危险信号”。MVA的生活周期允许疫苗抗原在感染细胞的细胞浆中合成，对抗原分子向MHC-Ⅰ类分子有效递呈，引发特异性CD8⁺T细胞反应特别有利。与复制型痘苗病毒不同，MVA的宿主范围很窄，对人类及其他哺乳动物仅产生一过性感染，接种后的副反应小。因此，许多利用MVA作载体的试验性疫苗已经在动物模型中显示了良好的保护性体液免疫与细胞免疫反应。也正是由于MVA载体具有的这些优点，使其从众多的活病毒载体中脱颖而出，成为当前重组病毒活载体疫苗研究的热点。本研究以PRRSV两个最主要的保护性抗原基因—ORF5及ORF6为目标基因，以MVA为载体对共表达PRRSV修饰的GP5与M蛋白的重组MVA的免疫效力进行了研究，主要研究內容如下：1．共表达PRRSv GP5与M蛋白的重组MVA的免疫效力研究本研究以MVA为载体构建了4个以不同方式表达PRRSV GP5与M蛋白的重组病毒—在两个启动子下共表达GP5与M蛋白（rMVA-GP5／M）、在一个启动子下融合表达GP5与M蛋白（rMVA-GP5-M）及单独表达GP5与M蛋白（rMVA-GP5与rMVA-M），利用Balb／C小鼠检测4个重组病毒引发的体液免疫与细胞免疫反应。重组病毒以5×10⁵TCID₅₀只的剂量肌肉注射试验小鼠，每组20只，在3周后加强免疫，利用微量中和试验检测中和抗体滴度以评价小鼠的体液免疫反应；利用商品化ELISA试剂盒检测γ-IFN、IL-2、IL-4的产量，以衡量小鼠的细胞免疫反应。结果表明，rMVA-GP5／M免疫组产生了最高滴度的中和抗体与最强烈的Thl型细胞免疫反应，rMVA-GP5-M免疫组所产生的免疫反应较rMVA-GP5／M免疫组弱，但是优于rMVA-GP5与rMVA-M免疫组，rMVA-GP5与rMVA-M不能产生明显的免疫反应。2．PRRSV GP5“A”表位的修饰与糖基化位点的突变对其免疫效力的影响为了提高PRRSV ORF5基因的免疫效力，对ORF5基因进行修饰。一方面，将CpG序列和通用型辅助性T淋巴细胞表位插入“A”表位与“B”表位之间，另一方面，对N33与N51位糖基化位点进行了点突变，获得修饰的ORF5（MORF5）。在此基础上构建了由两个CMV启动子调控的共表达MGP5与M蛋白的真核重组质粒pcDNA-M5A-6A．经westem-blot与IFA验证真核质粒的体外表达后，以100μg／只的剂量免疫6周龄Balb／C小鼠，每组20只，在3周后加强免疫，利用微量中和试验检測免疫后的中和抗体，利用商品化ELIsA试剂盒检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞分泌γ-IFN、IL-2及IL-4的能力，并与含有野生型ORF5的真核重组质粒pCDNA-5A-6A、弱毒疫苗以及灭活疫苗进行比较。结果表明，pcDNA-M5A-6A不但能够刺激免疫小鼠在较短的时间內产生更高水平的中和抗体，而且可以诱导产生更强烈的细胞免疫应答。3．改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统的改造本研究利用Cre／LoxP系统及表达Cre重组酶的BHK-21细胞系（BHK-Cre），以大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Eco gpt）为筛选标记构建最终可以删除标记基因的新型转移载体。将Eco gpt基因以及调控其表达的启动子基因（P7.5+Eco gpt）置于两个同向LoxP位点之间，多克隆位点位于两个同向LoxP位点之外。改造后的载体可以同时表达两个外源基因，重组病毒可以利用BHK-Cre删除筛选标记Eco gpt．4．共表达PRRSV修饰的GP5与M蛋白的重组MVA的构建及其生物学特性将PRRSV修饰的ORF5（MORF5）与ORF6基因分别克隆入经改造的MVA转移载体pLR-gpt的两个多克隆位点中，构建MVA重组转移质粒pLR-MORF5／ORF6。经脂质体介导，将构建好的pLR-MORF5／ORF6转染已感染亲本MVA 2h的BHK-21细胞单层，用药物选择性培养基（MXHAT）在24孔板上进行连续筛选纯化，得到带有筛选标记的重组病毒rMVAgpt-MGP5／M。将rMVAgpt-MGP5／M感染BHK-Cre，获得删除筛选标记的重组病毒rMVA-MGP5／M。PCR证明MORF5与ORF6基因成功的插入MVA基因组中；Western-blot检测与IFA证明重组病毒能正确表达MGP5与M蛋白；重组病毒与亲本MVA出现病变的时间及病毒滴度基本达到一致。以上结果表明，本研究成功构建了删除筛选标记的共表达PRRSV MGP5与M蛋白的重组MVA，并且表达产物具有免疫原性；外源基因的插入不影响MVA的复制，具较好的稳定性。5．共表达PRRSv修饰的GP5与M蛋白的重组MVA对猪的免疫效力研究为了检测rMVA-GP5／M对猪的免疫效力，将4周龄的健康仔猪随机分为6组，每组10头，设rMVA-MGP5／M（Ⅰ）、pcDNA-M5A-6A（Ⅱ、Ⅲ）与灭活疫苗（Ⅳ）4个免疫试验组，同时设立MVA亲本毒接种对照组（Ⅴ）及PBs空白对照组（Ⅵ）。肌肉注射免疫，重组质粒的免疫剂量为200μg／头，重组病毒免疫组与亲本毒对照组免疫剂量为5×10⁵TCID₅₀头，灭活苗免疫组按照使用说明进行，空白对照组每头注射2mL高压灭菌的PBS，4周后进行加强免疫，其中第Ⅲ组改用重组病毒免疫。首次免疫后每隔2周无菌采血，分离血清，利用细胞中和试验检测PRRSV特异性中和抗体水平；在首次免疫后30、50与70天，无菌采血，分离血液中的淋巴细胞，用PRRSV抗原刺激后检测其分泌PRRSV特异性细胞因子的水平。结果表明，加强免疫后2周，DNA→rMVA免疫组与rMVA→rMVA疫组都产生了可检测到的中和抗体，DNA→DNA在加强免疫后4周检测到中和抗体。在整个试验过程中，DNA→rMVA免疫组中和抗体水平最高。就细胞免疫反应而言，初次免疫后30天，各试验组细胞因子的产量没有明显差异；在初次免疫后50天，与亲本MVA及PBS对照组相比，3个试验组γ-IFN与IL-2的产量明显增多，与中和抗体的变化相一致的是DNA→rMVA免疫组的细胞因子（γ-IFN与IL-2）产量最高，与rMVA→rMVA免疫组及DNA→DNA免疫组差异明显，与中和抗体变化不一致的是rMVA→rMVA免疫组细胞因子（γ-IFN与IL-2）产量要比DNA→DNAA疫组高；初次免疫后70d，各组γ-IFN与IL-2的产量没有明显变化，说明加强免疫后Thl型细胞因子的分泌至少可以维持3周，在整个试验过程中，IL-4的产量没有明显变化；灭活苗免疫后，γ-IFN、IL-2以及IL-4的产量增加都不明显。