论文部分内容阅读
本论文由四部分组成,一是ELISA检测方法的建立,二是PCR检测方法的建立;三是利用PCR技术克隆出支气管败血波氏杆菌的fimN基因,四是利用大肠杆菌原核表达系统,通过基因重组技术表达出fimN基因,主要试验和结果如下:1.从杨凌随机采样50份兔血清,作为待检血清。用标准菌株(CUCC718)制备的灭活苗免疫家兔,采集血液制备血清作为阳性血清。将临床健康和菌体凝集抑制试验阴性兔的剖腹产胎儿的血清作为阴性血清。将标准菌株(CUCC718)制成外膜抗原,通过ELISA酶标抗体和阳性血清最适浓度的选择、外膜抗原最适浓度的选择试验,选用适当的抗原、抗体、酶标抗体浓度,设立空白孔、阳性孔、阴性孔做待检血清的ELISA试验,得出阳性判定值,若待检血清OD值大于阴性血清的临界值,则判为阳性,否则判为阴性。用建立的ELISA方法检测50份兔血清,与菌体凝集抑制试验得到了相同的结果,阳性21只,阳性检出率为42%。2.根据GenBank中支气管败血波氏杆菌菌毛蛋白基因(fimN)序列设计了一对引物,扩增出大小为648bp的目的基因片段,建立了快速检测兔支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明,该方法对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和巴氏杆菌均无交叉性反应。用该PCR法检测了从杨凌采集的50份表现临床症状的兔呼吸道分泌物检出支气管败血波氏杆菌阳性35例,阳性率为70 %。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较,结果显示,该PCR法的检出率是细菌检查法的3.89倍,是微量凝集法的1.94倍。3.将PCR产物648bp的基因片段克隆至pMD-19T Vector中,用EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切,获得目的条带,阳性质粒测序后与GenBank中的序列进行比较,同源性达99%,成功的构建了克隆载体pMD19T-fim N。4.用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pMD19T-fimN以及表达载体pET-32a(+),纯化回收后连接,转化JM109感受态细菌,获得重组质粒pETBb-fimN。酶切和序列分析鉴定目的基因的插入位置、方向正确,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测可得到分子质量约为41.71ku的目的蛋白,Western blot分析检测表明,表达的目的蛋白能被Bb阳性血清发生特异性结合。从而为建立用重组fimN蛋白作为诊断抗原的ELISA方法奠定了基础。