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鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是引起水产养殖动物弧菌病的重要病原菌,对我国大菱鲆、牙鲆、大西洋鲑、鳗鲡、鲈鱼等经济鱼种的危害性巨大。疫苗免疫是一种预防弧菌病的安全有效途径。针对我国缺乏商业化鱼用鳗弧菌疫苗的状况,本论文基于鳗弧菌流行病学研究的前期结果,针对主要流行于我国的鳗弧菌O1、O2血清型菌株研制了二价灭活疫苗,研究了其免疫大菱鲆的抗体产生持续期和免疫保护持续期,分析了免疫剂量、抗体效价和免疫保护率的关系,研究结果补充了鳗弧菌二价灭活疫苗的中试实验数据;进一步研究了鳗弧菌O3血清型菌株的免疫原性和免疫保护率,研究结果为进一步开展鳗弧菌O3血清型疫苗的临床前研究奠定了基础。具体研究内容和结果如下:1.鳗弧菌O1/O2血清型二价灭活疫苗的抗体产生持续期和免疫保护持续期。以O1血清型菌株VAM003和O2血清型菌株VAM007为抗原制备甲醛灭活二价疫苗,以不同免疫剂量对大菱鲆进行一次免疫和二次免疫,检测了免疫大菱鲆的抗体产生和持续时间、免疫保护产生和持续时间,实验持续时间为150 d。1.1一次免疫的抗体产生持续期和免疫保护持续期。以剂量107 cells/尾、108 cells/尾、109 cells/尾注射免疫大菱鲆一次,每组2500尾,在免疫后3 d、7 d、14 d、21 d、30 d、45 d、60 d、90 d、120 d、150 d检测免疫大菱鲆的血清抗体效价和疫苗的相对免疫保护率(Relative Percent Survival Rate,RPS)。血清抗体效价检测结果显示,在免疫后第7 d检测到各免疫剂量组的特异血清抗体效价为1:20~1:100.8,说明鳗弧菌二价疫苗在免疫后第7 d可刺激大菱鲆产生免疫应答。进一步分析结果显示,各免疫剂量组的血清抗体效价在逐渐增加后缓慢下降,在免疫后21 d~30 d检测到最高血清效价,按免疫剂量由低到高的顺序,三个剂量组抗VAM003的最高效价均为1:320,抗VAM007的分别为1:1015.9、1:1280、1:320。免疫剂量越高,免疫鱼维持较高血清抗体效价的时间越长,以血清效价大于1:20(有效抗体效价)为计,按免疫剂量由低到高的顺序,抗VAM003的较高抗体产生时间分别为7 d~90 d、7 d~120d、7 d~150 d,三个剂量组抗VAM007的高水平抗体时间均为7 d~150 d。上述结果表明,鳗弧菌二价灭活疫苗以较高剂量(108 cells/尾,109 cells/尾)一次免疫大菱鲆,有效抗体产生持续期为4个月以上。RPS的结果显示,在免疫后3 d,在不同免疫剂量的大菱鲆中均检测到抗VAM007的RPS为26.7%~30%;在免疫后7 d,在不同免疫剂量的大菱鲆中检测到抗VAM003的RPS为30%~60%,抗VAM007的RPS为5.9%~47.1%,这些结果表明鳗弧菌二价灭活疫苗一次免疫大菱鲆后3 d~7 d便提供免疫保护。免疫后14 d~90 d,在不同剂量的免疫鱼均检测到78.9%~100%的RPS,免疫剂量越高,免疫保护期越长,以RPS高于70%为有效免疫保护标准,按免疫剂量由低到高的顺序,大菱鲆抗VAM003的有效免疫保护持续时间为14 d~120 d、14 d~120 d、14 d~150 d,抗VAM007的为14 d~90 d、14 d~120d、14 d~150 d。上述结果表明,鳗弧菌二价灭活疫苗以107 cells/尾、108 cells/尾、109 cells/尾的剂量一次免疫大菱鲆,有效免疫保护期分别达90 d、120 d、150 d以上。血清抗体效价和RPS的相关性结果分析显示,二者呈现一定的正相关关系。按照免疫剂量从低到高的顺序,由相关性公式得出,血清抗体效价分别在1:40~1:320、1:20~1:320、1:80~1:201.6时,抗鳗弧菌VAM003的有效免疫保护率RPS>70%;血清抗体效价分别为1:201.6~1:1015.9、100.8~1280、1:63.5~1:320时,抗鳗弧菌VAM007的RPS>70%。1.2二次免疫的抗体产生持续期和免疫保护持续期。一次免疫后60 d,对107 cells/尾和108 cells/尾剂量组的大菱鲆分别以同等剂量进行二次免疫,与一免进行血清效价和RPS比较。结果显示,二次免疫后各组免疫鱼的血清抗体效价比一免鱼均有显著提高,免疫剂量越高,效价越高,按免疫剂量由低到高的顺序,抗VAM003血清效价分别为1:20~1:40、1:20~1:80(一免鱼分别为0~1:40、1:7.4~1:40),抗VAM007血清效价分别为1:100.8~1:320、1:160~1:640(一免鱼分别为1:63.5~1:253.9、1:40~1:320);免疫剂量越高,有效免疫保护时间越长,按免疫剂量由低到高的顺序,抗VAM003的有效免疫保护时间分别超过至120 d和150 d,抗VAM007的均超过150d。二次免疫后,免疫大菱鲆血清抗体效价与RPS也呈一定的正相关关系,按照免疫剂量从低到高的顺序,当二次免疫血清抗体效价分别为1:20~1:40和1:20~1:80,抗鳗弧菌VAM003的有效免疫保护率RPS>70%;当血清抗体效价分别为1:100.8~1:253.9和1:160~1:640,抗鳗弧菌VAM007的有效RPS>70%。综合上述结果,以鳗弧菌二价疫苗一次免疫大菱鲆,免疫剂量为107 cells/尾时的抗体产生时间超过90 d、有效免疫保护期超过90 d;免疫剂量为108cells/尾时的抗体产生时间超过120 d、有效免疫保护期超过120 d;免疫剂量为109 cells/尾时的抗体产生时间超过150 d、有效免疫保护期超过150 d。以鳗弧菌二价疫苗二次免疫大菱鲆,免疫剂量为107 cells/尾时的抗体产生时间超过150 d、有效免疫保护期超过120 d,免疫剂量为108 cells/尾时的抗体产生时间超过150 d、有效免疫保护期超过150 d。2.鳗弧菌O3血清型菌株的免疫原性和免疫保护效果。对三株O3血清型鳗弧菌(SMP1、SMP3和SMP4)进行复壮,检测了复壮菌株的半数致死量LD50分别为105.1CFU/m L(SMP1)、104.7 CFU/mL(SMP3)、105.4 CFU/m L(SMP4),制备了其甲醛灭活菌苗注射免疫牙鲆,分析了免疫鱼的血清抗体效价和RPS。结果显示,免疫后第7天可检测到免疫鱼血清的特异抗体效价,免疫后第4周的血清特异抗体效价为1:1280(SMP1)、1:640(SMP3)和1:905(SMP4),RPS为94.4%(SMP1)、100%(SMP3)和73.7%(SMP4)。结果表明三株O3血清型鳗弧菌菌株具有良好的免疫原性,SMP3最适合用作疫苗候选株。本研究为进一步开展鳗弧菌O3血清型疫苗的临床前研究奠定了基础。