哺乳动物卵母细胞冷冻保存对生物学和人类医学的研究与发展具有十分重要的价值,可为哺乳动物种质资源长期保存、人类辅助受精技术等生物技术的所需试验提供有效技术手段。但是,卵母细胞解冻后难以与精子结合、融合受精,其主要原因可能是卵母细胞在超低温冷冻保存过程中膜蛋白等结构发生不可逆变化,其中跨膜蛋白的变化有可能引起精卵不能粘附在一起或精子不能穿透卵母细胞的质膜。CD9属于四跨膜蛋白超家族成员之一,在多种组织、细胞上广泛表达,参与精卵结合和融合等重要生命活动。本研究以绵羊为模型动物,采用免疫荧光染色法、实时荧光定量PCR技术和免疫印迹法对冷冻前后GV期和MⅡ期卵母细胞CD9的分布进行定量定位分析；通过体外受精技术,探讨卵母细胞冷冻前后CD9表达量对精卵结合和融合能力的影响。本试验的主要研究结果如下：1 本研究收集和培养成熟的GV期和M Ⅱ期卵母细胞分别随机分为新鲜组和冷冻组。采用EG、DMSO和PROH联合冷冻保护剂的冷冻液进行冷冻不同发育期卵母细胞,探讨冷冻对卵母细胞发育能力的影响。结果显示,经过冷冻解冻后GV期卵母细胞成熟率(31%)显著低于新鲜组的(75%)(P<0.05)。细胞形态观察结果表明,冷冻解冻后GV期和M Ⅱ期卵母细胞形态正常率分别为55%和70%,新鲜GV期和M Ⅱ期卵母细胞形态正常率分别为92%和90%,两组之间差异显著(P<0.05)。2 采用免疫组织化学技术检测CD9蛋白在绵羊卵巢组织上的定位表达发现,CD9在卵泡壁层颗粒细胞、卵丘颗粒细胞和细胞膜上均有表达。并且原始卵泡时期即可检测到CD9荧光信号,随着卵泡的发育成熟,荧光信号逐渐增强,到达成熟卵泡时荧光信号达到最强。3 用实时荧光定量PCR检测CD9 mRNA表达水平。结果显示,新鲜MⅡ期卵母胞中CD9 mRNA的表达显著增高(P<0.05),其次为冷冻M Ⅱ期卵母细胞中的表达量(P<0.05),冷冻GV期卵母细胞CD9 mRNA的表达量最少(P<0.05)。免疫印迹法检测CD9蛋白水平上的表达量趋势和在冷冻解冻过程中GV期和M Ⅱ期卵母细胞CD9荧光显示趋势都与mRNA水平上的表达量趋势一致,即新鲜MⅡ期卵母细胞中CD9表达量最多,其次为冷冻MⅡ期卵母细胞中的表达,冷冻GV期卵母细胞上表达量最少。4 经体外受精试验检测CD9在每卵粘附精子数及精子穿透率中的影响。结果显示为冷冻GV期经IVM-IVF后粘附数和穿透率分别为2.9±0.6,34%；M Ⅱ期卵母细胞经冷冻解冻-IVF的数据为3.5±0.1,41%。以上两组实验结果都显著低于对照组的粘附数和精子穿透率(6.0±0.5,78%)(P,<0.05)。