灵芝属真菌具有重要的经济价值,很多种类是重要的药用真菌,而有些种类是重要的林木病原真菌,能够引起林木腐朽病害。在灵芝属系统学研究中,ITS作为真菌的通用DNA条形码被广泛应用,而EF1-α及RPB2基因在用于分子鉴定研究中具有更高的特异性,然而这些基因直接测序有时会出现双峰或杂合现象,在这些基因片段上可能存在一定的核苷酸多态性,而扩大种内的变异。本研究利用ITS,EF1-αα和RPB2基因对508份灵芝属标本进行PCR扩增和直接测序,对挑选出存在杂合或双峰现象的36份标本进行克隆和测序,挑选至少30个克隆子,所得序列比对后,对其样品内、样品间、种内的核苷酸多态性进行分析,进一步评估灵芝属三个基因片段的种内和种间变异范围,筛选出能够对灵芝属物种有效区分的DNA条形码。在PCR扩增和测序结果中,ITS基因中出现杂合或双峰现象的标本数量最多可达148份(29.13%),测序成功率仅有69.96%,而EF1-α和RPB2基因的杂合率分别为11.22%和5.71%,其测序成功率分别为87.55%和88.74%。序列核苷酸多态性分析后发现,灵芝属的ITS,EF1-α和RPB2序列中存在核苷酸多态性现象,且该现象可能较多的存在于灵芝属的ITS基因片段中,其个体内核苷酸多态性水平范围在0.18%-2.00%,EF1-α基因的多态水平较高,样品内多态性水平最高达3.57%,RPB2基因的样品内多态性水平较低,除无柄紫灵芝G.orbiforme样品外,其他样品个体多态性水平范围为0.085%-0.76%。核苷酸多态性现象一定程度上扩大了样品个体内和种内的序列差异,ITS,EF1-α及RPB2基因的种内最高序列差异分别为2.9%、4.0%和3.6%,因此这些基因片段中存在着种内差异大于种间差异的可能,从而影响物种的分子鉴定;同时,对于部分灵芝属物种来说直接利用克隆序列用于分子鉴定或系统发育分析可能存在一些问题。总之,与ITS和EF1-α基因相比,RPB2基因的杂合率低,测序成功率高,核苷酸多态性水平较低,种内序列差异较小且种间差异足够大。因此,RPB2基因可能更适用于灵芝属内的物种鉴定和系统发育分析研究。