研究背景我国是世界上食管癌的高发国家之一。尽管食管癌患者可以采取手术,放化疗等综合治疗方法,但患者5年存活率仍仅为30%左右。食管癌的侵袭和转移是患者生存率下降的主要原因,因此也成为了该领域研究的热点。在肿瘤侵袭和转移的过程中,上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发挥着尤为重要的作用。上皮细胞转化为间充质细胞是多细胞生物胚胎发育的关键步骤,并且对器官发育的结构特征具有决定性作用,而现在对其更多的研究主要集中于肿瘤的侵袭和转移方面。Elizabeth在温哥华举行的EMT会议上首次对其做了详尽的描述,并阐明了EMT机制在胚胎发育和肿瘤形成过程中的主要区别。肿瘤在侵袭和转移的过程中,肿瘤上皮细胞发生EMT后,E-钙粘蛋白(E-cadherin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)等上皮标志物表达降低,同时波形蛋白(Vimentin)、α肌动蛋白(α-smooth muscle actin,SMA)等间质标志物表达增加,致使上皮细胞极性丧失,细胞间粘附力下降,侵袭和转移能力增强,有利于肿瘤细胞从原发部位脱落形成局部浸润,并转移到远处部位。肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)是肿瘤组织中存在的极少数具有自我更新能力和分化潜能的肿瘤细胞。截止目前,已经在多种实体瘤中成功分选出了CSCs,并证实:这些细胞具备高致瘤能力,能够驱动肿瘤的形成,促进肿瘤转移,并且对放化疗具有高度耐受性。因此,研究学者广泛认为CSCs可能在肿瘤发生和转移中起重要作用,并有可能成为治愈癌症的靶点。p75NTR又称低亲和力p75神经营养素受体,已经证实:从食管正常组织和食管癌细胞系中分选的p75NTR+细胞具有显著的干细胞特性。目前,研究人员也已经将p75NTR作为分选正常食管上皮干细胞/祖细胞的标记物。缺氧是实体瘤中普遍存在的现象。以往观点认为:肿瘤细胞本身的特性是导致肿瘤侵袭和转移主要原因,而忽视了肿瘤微环境在其中发挥的重要作用。如今,研究表明:肿瘤的侵袭和转移是肿瘤细胞和肿瘤微环境相互作用的最终结果。缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是由HIF-1α和HIF-β组成的异源二聚体,是调节细胞对缺氧反应的主要转录因子。低氧条件下,HIF-1a与位于细胞核内的HIF-β结合形成异二聚体,进而与靶基因启动子或增强子上的低氧反应元件(hypoxic response elements,HREs)进行结合,启动下游基因的转录活性。研究表明:缺氧和缺氧信号通路能够对肿瘤细胞的幸存、侵袭和转移能力;肿瘤的血管生成以及对放化疗药物的耐受性进行调控,促进肿瘤的发生和发展。最近研究发现,在肿瘤转移的过程中,上皮肿瘤细胞发生EMT转变后,不仅其迁移和侵袭能力增加,同时还涉及代谢、表观遗传学以及分化等一系列复杂过程。分化的上皮肿瘤细胞可以通过EMT转化为未分化状态,不仅可以表达干细胞标志,而且可以获得干细胞样特征。更重要的是,缺氧以及缺氧信号通路在调控CSCs和EMT中都起到至关重要的作用,影响肿瘤的进展和预后。因此,探究缺氧微环境及缺氧信号通路对肿瘤侵袭和转移的影响是一项重要的研究课题。本实验拟探讨缺氧对食管鳞癌干细胞化的影响及在食管鳞癌EMT中的作用,进一步阐明食管鳞癌发生EMT的机制,探讨影响食管鳞癌EMT的可能因素。第一部分食管鳞癌细胞缺氧模型的建立及对HIF-1α表达的影响研究方法使用终浓度为150μmol/L Co Cl2的培养液培养食管鳞癌细胞株Eca-109用于模拟缺氧环境,并对Eca-109细胞进行不同时间(4h、8h、12h、24h、36h)的缺氧培养,并以常氧培养作为对照(常氧组)。1.形态学观察:于倒置显微镜下观察各组细胞的生长状态及细胞形态的变化,筛选出Co Cl2作用的最佳时间。2.Western blotting法:检测食管鳞癌细胞Eca-109在缺氧4h、8h、12h、24h和36h不同培养条件下HIF-1α蛋白的表达情况。3.Real-time PCR法:检测食管鳞癌细胞Eca-109在缺氧4h、8h、12h、24h和36h不同培养条件下HIF-1αm RNA的表达情况。结果1.形态学观察发现:与常氧组相比较,缺氧各组中细胞之间的连接松散,随着缺氧时间的延长,梭形细胞数量逐渐增多,此外,漂浮死亡的细胞也逐渐增多。缺氧24h组的细胞死亡量较缺氧12h组稍多,但不如缺氧36h组明显,为避免Co Cl2对细胞所产生的毒性作用,因此使用终浓度为150μmol/L Co Cl2、作用食管鳞癌细胞Eca-109 24h作为后续部分实验的缺氧组。2.Western blotting结果显示:HIF-1α蛋白的表达量在常氧组中为0.550±0.011,而进行不同时间的缺氧培养后,缺氧4h(0.941±0.020)、8h(1.070±0.018)、12h(1.079±0.032)、24h(1.103±0.025)和36h(0.984±0.014)组中HIF-1α蛋白的表达量均增加。缺氧各组与常氧组相比,其差异均具有统计学意义(P<0.05)。3.Real-time PCR结果显示:HIF-1αm RNA的表达量在常氧组中为1±0.066,与常氧组相比,缺氧4h组(0.631±0.113)和缺氧8h组(0.612±0.150)的HIF-1αm RNA表达量明显降低,而缺氧12h(2.612±0.250)、24h(3.948±0.930)和36h(3.052±1.350)组中的表达量明显增加,分别是常氧组的2.612倍、3.948倍和3.052倍。缺氧12h、24h、36h组与常氧组相比,其差异均具有统计学意义(P<0.05)。第二部分缺氧促进食管鳞癌细胞上皮-间质转化及肿瘤干细胞化研究方法1.Western blotting法:检测常氧组和缺氧组Eca-109细胞中Hi F-1α、E-cadherin、Vimentin、Oct-4、Nanog的蛋白表达情况。2.免疫荧光法:检测常氧组和缺氧组Eca-109细胞中Nanog蛋白的表达情况。3.Real-time PCR法:检测常氧组和缺氧组Eca-109细胞中Hi F-1α、E-cadherin、Vimentin、Oct-4、Nanog的m RNA表达情况。4.Transwell侵袭小室:检测常氧组和缺氧组中Eca-109细胞的体外侵袭能力。5.流式细胞术:检测常氧组、缺氧组和同型对照组Eca-109细胞中p75NTR+细胞的比例。结果1.Western blotting结果显示:食管鳞癌细胞Eca-109在常氧组中HIF-1α(0.437±0.022),E-cadherin(0.637±0.087)、Vimentin(0.823±0.037)、Oct-4(0.876±0.003)、Nanog(0.582±0.004)蛋白均有表达;在缺氧组中,HIF-1α(0.970±0.060)、Vimentin(1.240±0.020)、Oct-4(1.156±0.034)和Nanog(1.163±0.042)蛋白的表达均增加,而E-cadherin(0.168±0.048)蛋白的表达降低。缺氧组与常氧组相比,其差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.免疫荧光结果显示:与常氧组相比,在缺氧组Eca-109细胞中Nanog蛋白的表达量明显增加。3.Real-time PCR结果显示:HIF-α、Vimentin、Oct-4、Nanog的m RNA表达在常氧组中分别为1±0.228,1±0.214,1±0.249,1±0.333,与常氧组相比,缺氧组中HIF-1α(2.500±0.150)、Vimentin(2.185±0.070)、Oct-4(2.674±0.364)、Nanog(3.305±0.327)的m RNA表达量明显增高,分别是常氧组的2.5、2.185、2.674和3.305倍,E-cadherin的m RNA表达量在常氧组中为1±0.345,而在缺氧组中明显下降为0.123±0.058。缺氧组与常氧组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.流式细胞术实验结果显示:在常氧组和缺氧组中,p75NTR+细胞的比例分别为2.00±0.327%和2.74±0.137%,缺氧组与常氧组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。由此可见,正常情况下食管鳞癌细胞Eca-109中存在少量p75NTR+细胞,而缺氧能够增加Eca-109细胞中p75NTR+细胞的比例。5.Transwell体外侵袭实验结果显示:常氧组和缺氧组食管鳞癌细胞Eca-109的穿膜数分别为51±11.769、118±17.875,缺氧能够明显增强食管鳞癌细胞Eca-109的体外侵袭能力,且差异具有统计学意义(P<0.05)。全文结论1.缺氧能够诱导食管鳞癌细胞的上皮-间质转化,2.缺氧能够增强食管鳞癌细胞的体外侵袭力。2.缺氧能够诱导食管鳞癌细胞的干细胞化。