论文部分内容阅读
目的:初步探讨脂多糖诱导肺泡上皮细胞源性外泌体调控肺泡巨噬细胞炎症反应的分子机制。方法:通过miRNAs基因芯片技术比较正常肺泡上皮细胞来源的外泌体(AEC-Exo)和LPS诱导肺泡上皮细胞来源的外泌体(LPS-AEC-Exo)组间差异miRNAs表达谱并进行验证,筛选得到与炎症反应密切相关的miR-92a-3p;利用qRT-PCR技术分别检测LPS刺激下AEC中miR-92a-3p的表达情况以及LPS-AEC-Exo处理后AM中miR-92a-3p的表达情况;将miR-92a-3p mimic或inhibitor转染至AEC中,过表达AEC-Exo中的miR-92a-3p或沉默LPS-AEC-Exo中miR-92a-3p的表达后与AM共培养,检测各组AM中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达变化以及NF-κB信号通路激活情况;生物信息学预测miR-92a-3p的下游靶基因,检测调控AEC-Exo和LPS-AEC-Exo中miR-92a-3p表达后,各组AM中下游靶基因PTEN的表达变化;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-92a-3p与靶基因3’UTR区的靶向结合。结果:(1)miRNAs基因芯片结果显示:AEC-Exo与LPS-AEC-Exo间存在显著的miRNAs差异表达,与AEC-Exo相比,满足FC>2且P<0.05的miRNAs共有26个,其中上调13个,下调13个。在上调组中选取差异倍数前10的miRNAs进行芯片结果验证,利用qRT-PCR技术检测发现:与AEC-Exo组相比,筛选的前10个miRNAs在LPS-AEC-Exo中均高表达,且miR-92a-3p表达水平最高。(2)AEC-Exo、LPS-AEC-Exo和PBS分别与AM共培养12小时后,qRT-PCR检测miR-92a-3p在各组AM中的表达水平。结果显示,经LPS-AEC-Exo处理的AM比正常的AM具有更高水平的miR-92a-3p表达,提示LPS-AEC-Exo可将miR-92a-3p传递至AM中。(3)qRT-PCR技术检测发现过表达AEC-Exo中miR-92a-3p后,能够增加AM的IL-1β、IL-6、TNF-α水平,诱导AM炎症反应;而通过转染inhibitor沉默LPS-AEC-Exo中miR-92a-3p后,则能够削弱LPS-AEC-Exo诱导的AM炎症反应。(4)生物信息学分析预测提示PTEN基因的3’UTR与miR-92a-3p的种子区存在互补配对序列;双荧光素酶报告基因验证发现转染miR-92a-3p可使野生型PTEN-3’UTR载体的荧光素酶活性降低约40%,而对突变型PTEN-3’UTR载体的荧光素酶活性无明显影响。(5)Western Blot技术检测发现过表达AEC-Exo中miR-92a-3p后,能够抑制AM中PTEN蛋白水平,增加P-P65蛋白表达,而沉默LPS-AEC-Exo中miR-92a-3p后,使得AM中PTEN蛋白表达上调,NF-κB核移位受到抑制。结论:LPS-AEC-Exo通过miR-92a-3p靶向PTEN,激活AM中NF-κB炎症信号通路,诱导AM炎症反应。