第一部分在细胞水平探讨不同锌水平调控转运蛋白SLC39A5(ZIP5)表达在食管癌发生发展中的机制研究目的:食管癌是常见的恶性肿瘤,其发病率与死亡率均居高不下,严重威胁人类的健康。研究显示,微量元素锌的缺乏可能是食管癌的危险因素,SLC39A5(ZIP5)基因作为锌离子转运家族的一员,与体内的锌水平密切相关;我们前期体外实验发现正常锌水平下,ZIP5基因表达异常导致食管癌细胞的功能发生改变。本实验从细胞水平探讨不同锌水平与ZIP5基因表达的相互关系及其在食管癌发生发展中的作用,为食管癌的临床治疗和人群防治提供新的方法与思路。方法:1利用RT-PCR、Western Blot方法验证ZIP5基因在稳转食管癌细胞KYSE170空载体(KYSE170S)和ZIP5基因稳定低表达(KYSE170K)两种细胞中的表达水平;2采用低锌浓度(Deficient)、正常锌浓度(Normal)、25umol/l锌浓度培养基培养KYSE170S和KYSE170K两种细胞后进行相关实验2.1 利用 RT-PCR、Western Blot 方法检测 ZIP5 基因在 KYSE170S 和KYSE170K两种细胞中的表达水平;2.2 利用 MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)细胞比色法、平板克隆形成实验(colony-forming unit assays)、、流式乡细胞术(Flow Cytometry,FCM)、Transwell实验、划痕实验(scratchtest)检测KYSE170S和KYSE170K两种细胞在不同锌水平培养下的增殖、侵袭和迀移功能。结果:1 ZIP5稳转细胞验证:RT-PCR、Western Blot方法结果显示,与KYSE170S细胞相比,ZIP5基因在KYSE170K中的表达量分别降低了 37.5%、22.0%,两者相比均有统计学差异,验证了 ZIP5在KYSE170K细胞中低表达。2不同锌浓度培养KYSE170S和KYSE170K两种细胞时进行的相关实验2.1不同锌水平培养KYSE170S和KYSE170K两种细胞时ZIP5表达情况2.1.1不同锌水平培养两种细胞时ZIP5表达情况:低锌水平下培养两种细胞时,RT-PCR方法结果显示,ZIP5基因在KYSE170S细胞和KYSE170K细胞中表达量分别为0.25±0.01、0.14±0.02;两者相比有统计学差异。Western Blot方法结果显示,ZIP5基因在KYSE170S细胞和KYSE170K细胞中表达量分别为0.68±0.01、0.50±0.02;两者相比有统计学差异。25umol/l锌浓度下培养两种细胞时,RT-PCR方法结果显示,ZIP5基因在KYSE170S细胞和KYSE170K细胞中表达量分别为0.16±0.04、0.11±0.01;两者相比有统计学差异。WesternBlot方法结果显示,ZIP5基因在KYSE170S细胞和KYSE170K细胞中表达量分别为0.62±0.02、0.42±0.04;两者相比有统计学差异。结果说明低锌水平和25umol/l锌浓度培养时,ZIP5基因在KYSE170S细胞中的表达量均高于KYSE170K细胞。2.1.2同种细胞不同锌水平培养时ZIP5表达情况:KYSE170S细胞在不同锌水平培养下,RT-PCR方法、WesternBlot方法结果显示,ZIP5基因表达量在低锌水平、正常锌水平、25umol/l锌水平分别为0.25±0.01、0.17±0.02、0.16±0.04;低锌水平与正常锌水平、25umol/l锌水平相比均有统计学差异。Western Blot方法结果与RT-PCR方法结果相同。KYSE170K细胞在不同锌水平培养下时,RT-PCR、Western Blot方法结果显示,ZIP5基因表达量在低锌水平、正常锌水平、25umol/l 锌水平分别为 0.14±0.02、0.10±0.01、0.11±0.01;低锌水平与正常锌水平、25umol/l锌水平相比均有统计学差异。Western Blot方法结果与RT-PCR方法结果相同。结果说明ZIP5基因在KYSE170S和KYSE170K细胞中表达量随着培养基中锌水平的减少而升高。2.2不同锌水平培养KYSE170S和KYSE170K两种细胞时,细胞增殖功能变化情况2.2.1不同锌水平培养两种细胞时细胞增殖功能变化情况:正常锌浓度培养两种细胞时,MTS结果显示,KYSE170S细胞在Oh、24h、48h、72h、96h 时的 OD 值分别为 0.35±0.09、0.64±0.02、0.92±0.02、1.27±0.02、1.68±0.04;KYSE170K 细胞的 OD 值分别为 0.34±0.02、0.40±0.01、0.65±0.02、0.85±0.01、1.19±0.38。两两比较结果表明,细胞生长 24h、48h、72h、96h 后,KYSE170S 细胞与 KYSE170K细胞的增殖情况均有统计学差异。低锌培养两种细胞时,MTS结果显示,KYSE170S细胞在Oh、24h、48h、72hh时的OD值分别为0.38±0.05、0.67±0.02、0.95±0.02、1.22±0.16、1.75±0.01;KYSE170K细胞的 OD 值分别为 0.38±0.01、0.36±0.08、0.72±0.10、0.82±0.01、1.23±0.14。两两比较结果表明,细胞生长24h、48h、72h、96h后,KYSE170S细胞与KYSE170K细胞的增殖情况均有统计学差异。结果说明无论是正常锌水平还是低锌水平培养时,KYSE170S细胞的增殖速度均大于KYSE170K细胞。2.2.2同种细胞不同锌水平培养时,KYSE170S细胞和KYSE170K细胞在低锌水平和正常锌水平培养下细胞的增殖能力均无统计学差异。2.3不同锌水平培养KYSE170S和KYSE170K两种细胞时,细胞平板克隆形成情况2.3.1不同锌水平培养两种细胞时,细胞平板克隆形成情况:正常锌浓度培养时,平板克隆实验结果显示,KYSE170S细胞与KYSE170K细胞的克隆形成率分别为21.5%、16.2%;两者相比有统计学差异。低锌培养两种细胞时,平板克隆实验结果显示,KYSE170S细胞与KYSE170K细胞的克隆形成率分别为23.5%、18.1%;两者相比有统计学差异。结果说明无论是正常锌水平还是低锌水平培养时,KYSE170S细胞的克隆形成速度均大于KYSE170K细胞。2.3.2同种细胞不同锌水平培养时,KYSE170S细胞和KYSE170K细胞的克隆形成率均无统计学差异。2.4不同锌水平培养KYSE170S和KYSE170K两种细胞时,细胞周期变化情况2.4.1不同锌水平培养两种细胞时细胞周期变化情况:正常锌浓度培养两种细胞时,流式细胞术结果显示,KYSE170S和KYSE170K两种细胞的G0/G1百分比分别为32.98±1.02、26.24±0.65;两者相比有统计学差异。低锌培养两种细胞时,KYSE170S和KYSE170K两种细胞的G0/G1百分比分别为43.56±0.69、29.94±0.57;两者相比有统计学差异。结果说明无论是正常锌水平还是低锌水平培养时,KYSE170S细胞的细胞周期变化速度均大于KYSE170K细胞。2.4.2同种细胞不同锌水平培养时细胞周期变化情况:不同锌水平培养KYSE170S细胞时,流式细胞术结果显示,正常锌水平和低锌水平下G0/G1百分比分别为32.98±1.02、43.56±0.69,两者相比有统计学差异。不同锌水平培养KYSE170K细胞时,流式细胞术结果显示,正常锌水平和低锌水平下G0/G1百分比分别为26.24±0.65、29.94±0.57,两者相比也有统计学差异。说明随着细胞培养锌水平的增加,KYSE170S细胞和KYSE170K细胞的细胞周期变化速度均降低。2.5不同锌水平培养KYSE170S和KYSE170K两种细胞时,细胞侵袭能力变化情况2.5.1不同锌水平培养两种细胞时细胞侵袭能力变化情况:正常锌浓度培养两种细胞时,Transwell实验结果显示,KYSE170S细胞与KYSE170K细胞的穿透比分别为0.50±0.07、0.44±0.03;两者相比有统计学差异。低锌培养两种细胞时,Transwell实验结果显示,KYSE170S细胞与KYSE170K细胞的穿透比分别为0.63±0.01、0.54±0.02;两者相比有统计学差异。结果说明无论是正常锌水平还是低锌水平培养时,KYSE170S细胞的侵袭能力均高于KYSE170K细胞。2.5.2同种细胞不同锌水平培养时细胞侵袭能力变化情况:不同锌水平培养KYSE170S细胞时,Transwell实验结果显示,正常锌水平和低锌水平下KYSE170S细胞穿透比分别为0.50±0.07、0.63±0.01,两者相比有统计学差异。不同锌水平培养KYSE170K细胞时,Transwell实验结果显示,正常锌水平和低锌水平下KYSE170K细胞穿透比分别为0.44±0.03、0.54±0.02,两者相比有统计学差异。说明随着细胞培养基中锌水平的增加,KYSE170S细胞和KYSE170K细胞的侵袭能力均减弱。2.6不同锌水平培养KYSE170S和KYSE170K两种细胞时,细胞迁移能力变化情况2.6.1不同锌水平培养两种细胞时细胞迁移能力变化情况:正常锌浓度培养两种细胞时,划痕24h后,KYSE170S细胞与KYSE170K细胞的迁移面积分别减小为原来的0.43±0.06、0.72±0.14;两者相比有统计学差异。低锌培养两种细胞时,划痕实验结果显示,划痕24h后,KYSE170S细胞与KYSE170K细胞的迁移面积分别减小为原来的0.38±0.09、0.49±0.09,两者相比有统计学差异。结果说明无论是正常锌还是低锌培养时,KYSE170S细胞的迁移能力均大于KYSE170K细胞。2.6.2同种细胞不同锌水平培养时细胞侵袭能力变化情况:不同锌水平培养KYSE170S细胞时,划痕实验结果显示,正常锌水平和低锌水平下迁移面积分别减小为原来的0.43±0.06、0.38±0.09,两者相比有统计学差异。不同锌水平培养KYSE170K细胞时,划痕实验结果显示,正常锌水平和低锌水平下迁移面积分别减小为原来的0.72±0.14、0.49±0.09,两者相比有统计学差异。说明随着细胞培养基中锌水平的增加,KYSE170S细胞和KYSE170K细胞的侵袭能力均减弱。第二部分在整体水平探讨不同锌水平调控转运蛋白SLC39A5(ZIP5)表达在食管癌发生发展中的机制研究目的:据报道,营养元素锌的摄入不足可能是高发区食管癌的危险因素。我们的前期裸鼠荷瘤实验结果发现,正常锌水平时,沉默ZIP5基因会影响食管癌的发生发展。本实验从动物水平探讨不同锌水平与ZIP5基因表达的相互关系及其在食管癌发生发展中的作用,旨在探讨不同锌离子浓度调控ZIP5基因表达及其在食管癌中的发生发展机制,为食管癌的临床治疗和人群防治提供新的方法与思路。方法:1 通过 4-Nitroquinoline 1-oxide(4NQO)饮水法建立 C57BL/6 野生型(Wild type,WT)小鼠和 ZIP5 基因敲除(Knock Genotype,KO)小鼠的食管癌模型,诱癌过程采用低锌(Deficiency of zinc,DZ)饲料、正常锌(Normal concentration of zinc,NZ)饲料、低锌后正常锌(Supplement of zinc,SZ)饲料喂养两组小鼠。2实验小鼠诱癌过程中及诱癌成功后相关实验2.1利用HE染色检测上述三组不同锌水平喂养的WT小鼠和KO小鼠食管癌的诱癌成功率。2.2利用电感耦合等离子体质谱法检测低锌饲料、正常锌饲料喂养的WT小鼠和KO小鼠毛发、血液中的锌水平;2.3利用RT-PCR、免疫组化方法检测COX-2,STAT3和E-cadherin基因在正常锌饲料喂养的WT小鼠和KO小鼠食管癌中的表达。结果:1 WT小鼠与KO小鼠诱癌模型建立1.1通过4NQO饮水法建立食管癌模型结果显示,正常锌饲料喂养时,WT小鼠与KO小鼠的诱癌成功率分别是45.1%、9.5%,两者相比有统计学差异。补充锌饲料喂养时两者的诱癌成功率分别是59.2%、26.9%,两者相比有统计学差异。低锌饲料喂养时两者的诱癌成功率分别是90.6%、46.2%,两者相比有统计学差异。结果说明相同锌水平喂养小鼠时,WT小鼠的诱癌成功率均高于KO小鼠。1.2不同锌水平饲料喂养小鼠时,诱癌结果显示,WT小鼠的诱癌成功率两两相比均有统计学差异。不同锌水平饲料喂养小鼠时,诱癌结果显示,KO小鼠的诱癌成功率两两相比亦均有统计学差异。结果说明随着喂养锌水平的降低,WT小鼠与KO小鼠的诱癌成功率均升高。2不同组实验小鼠毛发锌水平检测结果2.1短期(12天)不同锌水平饲料喂养小鼠时,其毛发锌水平检测结果(mg/Kg)2.1.1短期(12天)正常锌水平饲料喂养小鼠时,WT小鼠与KO小鼠的毛发锌含量分别为236.12±39.08、183.99±41.73;两者相比无统计学差异。低锌饲料喂养时两者的毛发锌含量分别为217.38±34.38、131.26±20.62;两者相比无统计学差异。结果说明短期(12天)低锌饲料喂养时,WT小鼠与KO小鼠毛发锌含量无差别。2.1.2短期(12天)不同锌水平饲料喂养小鼠时,WT小鼠毛发锌含量无统计学差异;KO小鼠用不同锌水平饲料喂养时,其毛发锌含量亦无统计学差异。其余不同实验小鼠不同实验材料中锌含量均无统计学差异。2.2长期(28周)不同锌水平饲料喂养小鼠时,其毛发锌水平检测结果(mg/Kg)2.2.1长期(28周)正常锌水平饲料喂养小鼠时,WT小鼠与KO小鼠的毛发锌含量分别为144.07±0.58、129.22±5.61;两者相比无统计学差异。低锌饲料喂养时两者的毛发锌含量分别为123.76±2.65、107.19±5.26;两者相比有统计学差异。结果说明长期(28周)低锌饲料喂养时,WT小鼠毛发锌含量高于KO小鼠。2.2.2长期(28周)不同锌水平饲料喂养小鼠时,WT小鼠毛发锌含量有统计学差异;KO小鼠用不同锌水平饲料喂养时,其毛发锌含量亦有统计学差异。其余不同实验小鼠不同实验材料中锌含量均无统计学差异。3正常锌喂养WT小鼠与KO小鼠食管癌中COX-2,STAT3和E-cadherin基因的表达情况正常锌喂养WT小鼠与KO小鼠食管癌RT-PCR实验结果显示,WT小鼠与KO小鼠食管癌中COX-2基因的表达水平分别是0.62±0.17、0.19±0.14,两者相比有统计学差异。WT小鼠与KO小鼠食管癌中STAT3基因的表达水平分别是0.20±0.01、0.11±0.04,两者相比有统计学差异。WT小鼠与KO小鼠食管癌中E-cadherin基因的表达水平分别是0.04±0.02、0.50±0.28,两者相比有统计学差异。正常锌喂养WT小鼠与KO小鼠食管癌免疫组化实验结果显示,WT小鼠与KO小鼠食管癌中COX-2基因的表达水平分别是9.30±0.29、4.02±0.30,两者相比有统计学差异。WT小鼠与KO小鼠食管癌中STAT3基因的表达水平分别是6.35±0.29、1.17±0.24,两者相比有统计学差异。WT小鼠与KO小鼠食管癌中E-cadherin基因的表达水平分别是2.35±0.29、6.27±0.38,两者相比有统计学差异。结果说明COX-2,STAT3基因在WT小鼠食管癌中的表达量均高于KO小鼠;E-cadherin基因在WT小鼠食管癌中的表达量低于KO小鼠。结论:1锌水平下降时,食管癌KYSE170S细胞和KYSE170K细胞的增殖、侵袭和迁移能力均升高。在低锌与正常锌水平下,ZIP5表达下调均导致食管癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力降低。2膳食锌水平降低时,动物诱癌模型中食管癌发生率升高;膳食锌水平降低、正常或得到补充时,与野生型小鼠相比,ZIP5基因敲除小鼠的食管癌发生率降低。3动物诱癌模型显示,相同膳食锌水平时,ZIP5基因表达下调抑制了 COX-2和STAT3分子的表达,减弱了对E-cadherin基因的抑制作用,导致E-cadherin基因的表达上调,进而促进了食管癌的发生发展。