中药注射剂是我国特有的中药剂型,是中药应对急症重症的重要手段,它是以中医药理论为指导,采用现代科学技术和方法,将从中药或天然药物的单方或复方中提取的有效物质制成无菌溶液、混悬液或临用前配成溶液的灭菌粉末供注入体内的制剂。中药注射剂是传统中医药在现代发展的经典之作,它-改中药传统的给药方式,不经过胃肠道,直接进入血液,起效迅速,尤其适于急症重症。这种给药方式剂量准确并且不受消化系统及食物影响,临床上常用于神昏、抽搐、痉挛,或患消化系统障碍的患者,有着确切的临床疗效。近些年来,随着中药注射剂应用的不断扩大,临床不良反应的相关报道数量也呈上升趋势,其主要不良反应包括皮肤及粘膜损害、呼吸系统损害、心血管系统损害及药物热等。同时一种症状类似于过敏反应的不良反应也时有发生,它与经典的过敏反应不同之处在于,经典途径的过敏反应过敏原首次进入机体后,致敏机体产生特异性的IgE,当过敏原再次刺激机体时,被特异性地识别,并与抗体发生反应,导致机体肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒,释放大量生物活性物质,继而引发一系列免疫效应；而类过敏反应的发生,不需预先接触抗原物质,也无特异性IgE参与,因其临床症状与过敏反应相似而得名,但准确机制尚不明确。然而,针对注射剂的过敏反应,《中国药典》(2010版)仅收录豚鼠主动全身过敏试验(ASA)和被动皮肤过敏试验(PCA)两项。豚鼠易于致敏,曾是理想的过敏试验对象,常规的过敏试验也多采用豚鼠作为模型。但由于豚鼠个体较小时行为改变不够典型和明确,加之行为学观察本身也存在较多主观因素,使得豚鼠试验容易出现假阳性或假阴性的结果。另外豚鼠的全身主动过敏试验和被动皮肤过敏试验主要针对依赖IgE介导的经典途径过敏反应,检测效果确切,但中药注射剂常引发类过敏反应,豚鼠试验的检测效果并不理想,常出现漏筛的现象,这也是导致中药注射剂过敏反应频发的原因之一。因此,寻找针对中药注射剂所引发类过敏反应的筛查模型是控制中药注射剂用药安全的重要举措。本文将从体外细胞模型着手,筛选出最适宜的针对性强的类过敏反应体外筛查模型,作为中药注射剂应用于临床前的安全性检查,或作为筛查中药注射剂中致敏成分的筛查模型,给中药注射剂的安全使用和二次开发奠定基础。目的：1在常用的肥大细胞及嗜碱性粒细胞系中筛选出一种最适合作为中药注射剂引发类过敏反应体外筛查模型的细胞系。2利用临床常用的几种中药注射剂,评价所筛选出的细胞系与临床的符合率。方法：1.测定细胞生长曲线：取对数生长的三种细胞,按不同浓度接种于96孔板中,分别用MTT法与CCK-8法测定培养0d,1d,2d,3d,4d,5d的细胞活力,每个时间点,每种细胞,每个浓度6个复孔。其中MTT组每孔加入10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液,孵育4h后吸弃培养液,加入DMSO溶液震荡溶解,酶标仪570nm处测定各孔的吸光度；CCK-8组每孔加入10μL CCK-8溶液,培养1h后,酶标仪450nm测定各孔的。测得吸光度利用SPSS13.0计算均数及方差,分别对不同浓度的不同种类细胞利用Office Excel2010对所求得的吸光度均数和培养时间绘制生长曲线。2.筛选用于建立体外肥大细胞脱颗粒模型的细胞系2.1组胺释放量测定分别取对数生长期的三种细胞,接种于24孔板中,生长48h后,弃去培养基,加入Tyrode液培养条件下平衡10分钟。实验组加入50μL C48/80,并设置空白对照组加入等体积Tyrode液。分别反应0min,15min,30mmin,45min和60min后终止反应。于0-4℃以2000r/min离心10min,取上清液备用。Ku812直接以平板离心机相同转速离心取上清液备用。2.2高效液相色谱-质谱(LC-MS)法测定组胺含量C18固相萃取小柱活化后上样,以0.2%氨水3mL冲洗,再加入3mL甲醇,收集甲醇液,室温下氮气吹干,加入0.5mL甲醇充分溶解后,过0.22μm滤膜备用。色谱条件：流动相为乙腈：加入0.3%甲酸的0.5mmol/L醋酸铵水溶液(60：40)；色谱柱：Alltima Phenyl C18柱(250mm×4.6mm,51μm)；流速：0.8mL/min；柱温：35℃。用Office Excel2010软件,以不同组胺标准品峰面积积分对浓度进行线性回归计算,得出标准曲线方程后计算各样品组胺含量。2.3氨基糖苷酶净释放度测定分别取对数生长期的三种细胞,接种于96孔酶标板中,加入50μL底物,生长48h后实验组每孔加入50μL C48/80；氨基糖苷酶总含量对照组加入50μL0.3%TritonX-100细胞裂解液,将全部膜裂解,释放所有的氨基糖苷酶,作为氨基糖苷酶总含量对照组；空白组加入等量Tyrode液。分别反应0min,15min,30min,45min,60min后加入150μL终止液终止反应,酶标仪测定405nm处各孔反应液的吸光度,结果扣除空白对照后,以实验组即C48/80刺激组吸光度与氨基糖苷酶总含量对照组裂解全部膜后的吸光对之比,衡量实验组C48/80刺激后氨基糖苷酶的释放度。2.4脱颗粒百分率分别取对数生长期的三种细胞,接种于24孔板中。生长48h后,弃去培养基加入Tyrode液,平衡10分钟。实验组加入50μL C48/80刺激,并设置空白对照组加入等量Tyrode液。分别于0min,15min,30min,45min和60min终止反应并以中性红染色。随机计数100个细胞中脱颗粒细胞的个数,计算出脱颗粒百分率。以上结果以SPSS13.0统计软件析因设计方差分析。其中组胺测定时的峰面积积分对浓度进行的线性回归计算,使用Office Excel2010。3.几种常见中药注射剂对P815细胞脱颗粒的影响3.1检测几种常用中药注射液对P815细胞的ICso浓度中药注射剂样品以制剂原液为母液,稀释为一定浓度梯度,共设置连同母液在内的6个浓度,实验依次设空白对照组,6个浓度的注射剂组,每组设6个复孔。取对数期生长的P815细胞接种于96孔板中,培养12h后,空白对照组加入50gL培养液,注射剂组加入50μL不同浓度中药注射剂,继续培养36h,每孔加入室温平衡过的MTT溶液,相同条件下孵育4h,吸弃培养液,另加入DMSO震荡溶解,测定各孔的吸光度,以SPSS13.0计算各注射剂品种各浓度吸光度均数,依照改良寇式法计算IC50。每种注射剂平行测定三次利用SPSS13.0取平均值。3.2几种常见中药注射剂对P815细胞脱颗粒的影响以筛选建立体外肥大细胞脱颗粒模型的相同方法检测各种中药注射剂在其IC50浓度下对P815细胞刺激60min后的组胺释放量,氨基糖苷酶净释放度和细胞脱颗粒率三项指标。实验过程中设置以C48/80刺激的阳性对照组和以Tyrode刺激的阴性对照组。结果以SPSS13.0统计软件One Way Anova方法分析。结果：1.测定细胞生长曲线：MTT法和CCK-8所测定的同种细胞的生长曲线趋势基本相同,测定结果得出RBL-2H3细胞在0.8×105个/mL-1.0×105个/mL范围内,P815细胞在0.5×105个/mL-0.8×105个/mL范围内,Ku812细胞在0.8×105个/mL-1.0×105个/mL范围内生长曲线有明显的指数生长期和平台期,没有明显的潜伏期,并且48h左右能够进入或接近平台期。细胞在该浓度下,适宜进行本文后续的其他实验。2.筛选用于建立体外肥大细胞脱颗粒模型的细胞系C48/80刺激后0-60min,三细胞系过敏活性物质释放均有明显增加,以析因设计方差分析的方法统计后,根据交互效应轮廓图可见,在相同刺激条件下,P815的组胺释放量,细胞脱颗粒率和氨基糖苷酶净释放度三项指标的突增均明显较其他两种细胞系发生时间早,突增效果明显。Ku812为悬浮细胞,细胞脱颗粒状况不宜观察,其结果只作为Ku812在各刺激时间点之间的比较,与同刺激时间点的其他两种细胞无可比性,这也可说明Ku812在细胞脱颗粒项目下,不利于实验观察。关于作用时间,根据临床报道,类过敏反应常发生在注射给药后60min内发生,将P815细胞的各项指标相邻两个时间点两两比较,根据交互效应轮廓图,选择60min为刺激时间。3.几种常见中药注射剂对P815细胞脱颗粒的影响在被检测的十二种注射剂中,血栓通注射液、清开灵注射液、双黄连粉针剂及水针剂、香丹注射液、肿节风注射液、胆木注射液、丹参注射液、苦参碱注射液在三项指标的检测中与阴性对照组相比均有明显的统计学差异,即P<0.05,提示上述注射剂品种对P815细胞有较强的致敏性；相对而言,柴胡注射液、银杏提取物注射液、生脉注射液三项检测指标与阴性对照组差异不显著,提示上述三种注射剂对P815细胞的致敏性相对较弱。结论：以在P815、RBL-2H3、Ku812三种肥大细胞和嗜碱性粒细胞的细胞系中,以P815细胞系最适宜作为中药注射剂引发类过敏反应体外筛查模型。P815细胞在C48/80刺激下,表现出显著的脱颗粒反应,且反应结果易被量化检测,重复性较好。在几种常见中药注射剂刺激下,以本实验设计的检测方法测定,引起细胞脱颗粒程度与国家食品药品监督管理局的官方公示和《药物不良反应通报》中所述的中药注射剂不良反应发生情况吻合度较高。P815细胞在临床报道致敏性较高的中药注射剂刺激下,所测得指标结果与阴性对照差异明显；同时在临床报道致敏性不明显的中药注射剂刺激下,所测得指标结果与阳性对照差异明显。提示P815可能是一种新的检测效果确切的针对中药注射剂类过敏反应的快速稳定的体外过敏物质筛选模型。