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PCa是男性最常见的恶性肿瘤之一,大多数PCa病人治疗失败和最终死亡的主要原因是由于肿瘤细胞对化疗药物产生耐受并出现局部侵袭及远处转移。尽管新研发的药物使得对PCa的控制取得了一些进步,但研究其化疗耐药和侵袭的机制、寻找有用的治疗靶点、开发新的治疗方法、改善目前的治疗现状以及延长病人的生存时间仍然是当务之急。miRNA是一组内源性、小的、非编码、单链RNA,它可通过与靶基因mRNA的3’-UTR序列相结合,最终导致靶基因mRNA的翻译受到抑制或彻底降解,因而能够在转录后水平调控靶基因的表达。现有证据表明,作为癌基因或肿瘤抑制因子,miRNA在多种癌中异常表达。许多报道表明,一些miRNA在PCa化疗耐药和侵袭中起重要作用。本研究选取miR-128,通过生物信息学方法分析预测其可能的靶基因及其结合位点,探讨miR-128对PCa化疗敏感性和侵袭性的影响及其可能的机制。第一部分：miR-128在前列腺癌中表达及功能的研究目的 检测miR-128在PCa和正常前列腺组织中的表达情况,探讨miR-128对PCa细胞化疗敏感性和侵袭性的影响。方法收集武汉大学人民医院8例PCa和正常前列腺组织,所有标本均经病理证实,real-time RT-PCR分别检测PCa组织和正常前列腺组织中miR-128的表达情况。将miR-128 mimic和Scramble分别转染PCa细胞系DU-145和LNCaP, real time RT-PCR检测转染细胞中miR-128的表达水平。将转染成功的PCa细胞系分别加入不同浓度梯度的顺铂(cDDP),采用MTS法检测癌细胞存活情况,采用Transwell法检测转染后的PCa细胞侵袭能力的变化。结果real-time RT-PCR检测PCa和正常前列腺组织中miR-128的表达情况,发现PCa组织中miR-128的表达水平较正常前列腺组织低,其差异有显著性。miR-128 mimic使得DU-145和LNCaP细胞系中miR-128的表达量分别上调15.93倍和13.07倍,其差异具有显著性。与对照组相比,实验组PCa细胞的存活率下降,发生侵袭的PCa细胞数量减少。结论miR-128在PCa组织中表达下调,并能增加PCa细胞对cDDP的化疗敏感性,抑制其侵袭性。第二部分：前列腺癌中miRNA-128靶基因的研究目的 预测miRNA-128的靶基因,从mRNA和蛋白质水平检测靶基因在PCa和癌旁正常前列腺组织中的表达情况,探讨其对PCa细胞化疗敏感性和侵袭性的影响。方法通过miRNA公共数据库查询miR-128可能的靶点,筛查具有保守结合位点的基因,结合文献检索最终确定研究对象。real time RT-PCR和western blot分别检测PCa和癌旁正常前列腺组织中ZEB1的表达水平。分别构建pMir-ZEB1-wt和pMir-ZEB1-mut表达载体,将pMir-ZEB 1-wt/mut与miR-128 mimic/Scramble分别共转染HEK-293T细胞,检测荧光素酶活性变化。针对ZEB1的不同区域设计三种不同的siRNA,分别转染入DU-145细胞系,western blot检测RNAi效率,挑选沉默效果最好的siRNA-ZEB1作为后续研究的实验组。将阴性对照、沉默效果最好和最差的siRNA-ZEB1分别转染DU-145和LNCaP细胞系,加入不同浓度的cDDP, MTS法检测转染后癌细胞的存活情况,Transwell检测转染后的PCa细胞的侵袭性变化。结果综合miRNA公共数据库和文献检索的结果,最终确定ZEB1为进一步研究的靶点。与正常组织相比,real time RT-PCR和western blot检测癌组织中ZEB1的mRNA口蛋白质的表达水平均升高,其差异具有显著性。双荧光素酶报告基因实验发现,转染了pMir-ZEB1-wt的HEK-293T细胞系中,荧光素酶的活性明显降低,而转染了突变型pMir-ZEB1-mut的细胞系则没有这样的变化,其差异具有统计学意义。western blot筛选出siRNA-ZEB1-#1的沉默效率最高,用作实验组,siRNA-ZEB1-#2沉默效果最差,用作对照组,分别转染PCa细胞系,与对照组相比,实验组PCa细胞存活率下降,发生侵袭的PCa细胞数量减少。结论miR-128直接靶向调控ZEB1, ZEB1在PCa组织中表达上调,并能降低PCa细胞对化疗的敏感性,提高其侵袭性。第三部分：前列腺癌中miR-128靶向调控ZEB1机制的研究目的探索PCa中miR-128与ZEB1的靶向调控机制方法将DU-145和LNCaP分别转染miR-128 mimic和Scramble后,real time RT-PCR和western blot分别检测ZEB1的表达水平。进一步构建pLEX-ZEB1-ORF表达载体,以pLEX-MCS作为对照,分别将它们和miR-128 mimic共转染DU-145和LNCaP细胞,real time RT-PCR和western blot分别检测PCa细胞中ZEB1的表达情况。在共转染PCa细胞中分别加入不同浓度的cDDP, MTS法检测癌细胞存活情况,Transwell检测PCa细胞侵袭性变化。结果DU-145和LNCaP分别转染miR-128 mimic和scramble后,与对照组相比,实验组细胞中ZEB1的mRNA的表达分别下降74%和63%,其差异具有显著性,ZEB1蛋白质表达水平也明显下调。与对照组相比,转染了pLEX-ZEB1-ORF的实验组细胞中ZEB1的mRNA表达量分别上升3.87倍和4.81倍,其差异具有显著性,ZEB1蛋白质的表达水平也明显上升。MTS检测显示转染miR-128 mimic后,实验组PCa细胞的存活率反而升高,发生侵袭的PCa细胞数量增加。结论miR-128可抑制PCa细胞中ZEB1的表达水平,共转染miR-128 mimic和pLEX-ZEB1-ORF后,PCa细胞中ZEB1表达水平升高,pLEX-ZEB1-ORF可逆转miR-128对PCa细胞的化疗敏感性和侵袭性效应。