丹参(Salvia miltiorrhiza Bge),俗称活血根,是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物,年需求量15000吨左右,是栽培面积较大的药材之一。但是,随着丹参栽培年限延长,根部病害的发生率逐年提高,栽培2-4年丹参根部病害的发生率达到了60%-70%,严重影响丹参的产量和质量,而丹参根部病害的化学防治效果甚微。目前采用生物防治方法是解决中药材根部病害的最佳选择。丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi, AMF)在抗植物土传病害方面具有很大的潜力,但是AMF对于不同的病原菌,其抗病性不同。国内外关于AMF对植物病害的抗病机理也没有统一定论。本论文主要针对丹参栽培过程中的上述问题,采用AMF作为生防菌,研究AMF对丹参根部病害的抗病规律及其机理。其旨在有效缓解栽培丹参根部病害的发生,为提高丹参的产量和质量提供指导,同时为中药材根部病害的研究提供一种新的思路和方法。实验方法1、丹参根部病害病原菌的分离、纯化与鉴定。(1)采集丹参病株,取病健交界部位采用PDA培养基分离纯化病原菌,记录菌落形态特征,在光学显微镜下观察培养病原菌的分生孢子和分生孢子梗形态,并测量其大小。根据病原菌的菌落形态及产孢结构,对其进行传统形态学鉴定。(2)采用CTAB法提取病原菌DNA,选取真菌通用引用ITS扩增目的核酸片段,测序,在NCBI的GENBANK库中进行序列比对,判断所获菌株的种类或其近缘的物种。2、在温室盆栽条件下,采用蘸根接种病原菌的方法,研究病原菌对丹参幼苗的致病性及生理生化方面的影响。(1)采用计数法计算植物发病率,并统计接菌后7d对地上和地下部分鲜重的影响。(2)分别检测病原菌处理后1d、3d、5d、7d、11d对丹参幼苗根内多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)四种与植物诱导抗病性相关的防御酶活性的变化情况。(3)选择SA途径和JA途径上的病程相关蛋白和防御基因序列,设计引物,采用RT-qPCR的方法于病原菌蘸根处理后3d、5d、7d,对丹参幼苗根中的病程相关基因表达变化进行分析。(4)采用SPSS16.0统计软件对实验结果进行统计分析。3、在温室盆栽条件下,研究不同种类丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi,AMF)[摩西球囊霉(Glomus mosseae, GM)、地表球囊霉(Glomus versiforme, GV)、根内球囊霉(Glomus intraradices, GI)]对丹参生长及有效成分的影响。(1)根据Bierman和Linderman(1981)建立的方法测定不同AMF处理后365天的菌根侵染率以评估不同AMF与丹参的共生情况。(2)考察不同AMF处理后365天对丹参株高,地上地下部分分枝数,地上地下部分干重等生物量积累的影响。(3)采用国际上通用的Li-6400便携式光合作用系统考察不同AMF处理后丹参幼苗叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)和胞间C02浓度(Ci)等气体交换参数的动态变化,并同时测定了叶片中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和可溶性糖含量,从光合作用的角度阐释AMF影响丹参生物量积累的机理。(4)采用ICP-AES法检测接种AMF对丹参地上部分、地下部分大量元素钾K,微量元素铜Cu、锌Zn、镁Mg、铁Fe、锰Mn、钙Ca含量的变化情况。(5)采用HPLC法检测接种AMF对丹参植株水溶性成分迷迭香酸和丹酚酸B以及脂溶性成分丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、二氢丹参酮、丹参新酮积累的影响。(6)采用SPSS16.0统计软件对实验结果进行统计分析。4、在温室盆栽条件下,采用蘸根接种病原菌的方法,研究AMF对丹参根部病害的防治效果及其抗病机理。(1)采用计数法计算植物发病率,根据病害分级标准,计算病情指数,并统计接菌后20d对地上和地下部分鲜重,株高、根长的影响。(2)采用WinRHIZO根系分析系统观测接菌后20d不同处理组根长(Length),根面积(SurfArea),根投影面积(ProjArea),根体积(Volume)和根尖数(Tips),以及根的发病部位(Disease)与健康部位(Healthy)的颜色对比分析,阐释AMF对丹参根部病害的防治效果。(3)采用MIN-PAM调制式荧光分析仪测定接菌后14d不同处理组丹参植物叶片最大光化学量子PSⅡ产量Fv/Fm、最大光化学量子PS Ⅱ效率Yield、光化学碎灭系数qP、非光化学碎灭系数qN等叶绿素荧光参数,并同检测叶片叶绿素含量,可溶性糖含量,从光合作用的角度阐释AMF和／或病原菌处理影响丹参生物量积累的机理。(4)采用考马斯亮蓝染色法测定接菌后5天蛋白质含量,测定苯丙氨酸解氨酶活性,并采用植物几丁质酶、p-1,3葡聚糖酶酶联免疫(ELISA)检测试剂盒对植物根中几丁质酶和p-1,3葡聚糖酶活性进行检测,从生理生化的角度阐释AMF的抗病机理。(5)采用RT-qPCR的方法对接菌处理后3d的不同处理组丹参幼苗根内病程相关蛋白基因PR10和防御基因PDF2.1的表达变化进行检测,从抗病基因表达的角度阐释AMF提高丹参抗病性的机理。结果1、病原菌分离鉴定结果传统鉴定方法和分子生物学鉴定方法结果表明：引起山东莱芜丹参种植基地根部病害的病原菌为轮枝孢属(Verticillium)的大丽轮枝菌Verticillium dahlia(VD)和镰刀菌属(Fusarium)尖孢镰刀菌的转化型黄瓜枯萎病菌Plectosphaerella cucumerina(PC).2、病原菌对丹参幼苗生理生化方面的影响病原菌对丹参幼苗的致病性：病原菌PC和VD处理14d后,丹参幼苗的发病率和病情指数显著高于对照组(P<0.05),其中PC组发病率显著高于VD组,表明PC对丹参幼苗致病性更强。病原菌对丹参幼苗生物量的影响：病原菌处理丹参幼苗后7d,地上部分、地下部分鲜重低于对照,但无显著差异(P>0.05)病原菌对丹参幼苗酶活性的影响：病原菌处理丹参幼苗后1-11d,丹参根中的PPO、PAL、POD和SOD四种与植物诱导抗病性相关的关键酶活性随时间变化逐渐升高,随后其活性逐渐降低,其中PC处理组PPO、PAL、POD和SOD活性都在处理后5d达到峰值,并显著高于对照组和PC组(P<0.05)；VD组PPO、PAL、POD活性在处理后5d达到峰值并显著高于对照组(P<0.05),SOD活性在处理后7d达到峰值,并显著高于对照组和PC组(P<0.05)。病原菌对丹参幼苗抗病基因表达的影响：病原菌PC处理丹参幼苗后3d,病程相关蛋白基因PR10与防卫基因PDF2.1的相对表达量显著高于对照(P<0.05)。病原菌VD处理丹参幼苗后5d,病程相关蛋白基因PR10与防卫基因PDF2.1的相对表达量显著高于对照(P<0.05)。PC处理组丹参根中基因PDF2.1和基因PR10的表达高峰都先于VD处理组出现,且最高表达量都大于VD组,表明丹参幼苗对黄瓜枯萎病菌更敏感,能快速的产生防御反应。3、不同AMF对丹参生长及有效成分的影响AMF与丹参根系的共生情况：三种AMF均能有效地侵染丹参根系,不同的AMF其菌根侵染情况存在一定差异,GV组丹参的菌根侵染率显著高于GM组和GI组(P<0.05),表明GV更容易侵染丹参根系,并与丹参形成互惠共生体。AMF对丹参生长情况的影响：接种AMF处理的丹参植株地上、地下部分分枝数,地上、地下部分干重均显著高于不接种处理组(P<0.05),对株高无显著影响(P>0.05)。三种AMF对丹参生长的促进作用不同,接种GM处理的丹参根长显著大于接种GV和GI处理(P<0.05)。接种GV处理的丹参植株地上、地下部分干重,地上、地下部分分枝数均显著高于接种GM和GI处理(P<0.05)。表明GV促进丹参生长效果最好。AMF对丹参植株矿质元素的影响：接种AMF能显著提高丹参叶中Mn、Fe、Mg和Ca元素含量(P<0.05),Cu含量略有所提高,而Zn、K的含量略有降低,但无显著差异(P>0.05),同时能显著提高丹参根中Cu、Mn、Fe的含量(P<0.05),Zn、Mg、Ca的含量略有提高,K的含量略有降低,但都不显著(P>0.05)。GV处理组丹参叶中Mn、Fe、Mg、Ca的含量显著高于其他菌根处理组(P<0.05)。GM处理组丹参根中Cu、Mn、Fe含量显著提高(P<0.05),GV组的K、Zn、Mg和Ca的含量均高于其他处理组,但无显著性差异(P>0.05)。三种AMF均能促进丹参植株对矿质元素的吸收。AMF对丹参植株光合作用的影响：①接种AMF后丹参叶片Pn、Tr、Gs均显著高于CK(P<0.05)。接种GV,Pn和Tr显著高于GI和GM处理(P<0.05)。②AMF处理组叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素的含量均高于CK组,其中GV的叶绿素a,总叶绿素含量高于GI和GM处理,GI的类胡萝卜素、叶绿素b的含量高于其它处理组,但均无显著性差异(P>0.05)。③AMF处理组植株叶片可溶性糖含量都高于CK,其中GV组和GM组有显著性差异(P<0.05),尤以GV组含量最高。表明接种AMF能促进植株叶片可溶性糖含量的积累,可能与AMF提高丹参光合作用效率有关。AMF对丹参植株水溶性化学成分的影响：AMF处理能提高丹参叶和根中水溶性化学成分迷迭香酸和丹酚酸B的含量(P<0.05),其中GV处理组高于GM和GV处理组,叶中含量差异显著(P<0.05),根中含量差异不显著(P>0.05)。实验结果表明,接种AMF能够显著促进丹参叶和根中水溶性化学成分迷迭香酸和丹酚酸B的积累,尤以接种GV水溶性化学成分积累效果最明显。AMF对丹参植株脂溶性化学成分的影响：AMF处理组丹参根中脂溶性化学成分丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、二氢丹参酮、丹参新酮的含量均高于CK,其中GV处理组丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量高于GM和GI处理组,GI处理组二氢丹参酮和丹参新酮含量高于其它处理组,但都无显著性差异(P>0.05)。4、AMF对丹参抗病及抗病机理研究植株的发病情况：接种菌根真菌G.versiforme处理组发病率,病情指数显著降低(P<0.05),其对丹参根部病害的相对防效为62.50%。生物量及根系形态：接种有菌根真菌丹参根系鲜重,根长,根投影面积和根表面积显著大于未接有病原菌的处理(P<0.05),表明GV能促进丹参生物量的积累和根系生长发育。接有病原菌处理组丹参地上部分鲜重,根系鲜重,根长,根投影面积,根表面积和根尖数分别相比较于无病原菌处理的均有降低的趋势,只有根尖数和地上部分鲜重降低不显著(P>0.05),其中预先接种有菌根真菌的处理组丹参根长,根投影面,根表面积,健康根系的比例显著大于只接种病原菌处理组(P<0.05),表明病原菌对丹参生物量的积累和根系的生长有抑制作用,而菌根真菌GV能降低病原菌对丹参生物量积累和根系生长的负面影响,减轻根系病害。光合作用：病原菌处理使得PSⅡ最大光化学量子效率(Φ-PSⅡ)、PSⅡ最大光化学量子产量(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qP)和非光化学猝灭系数(qN)分别都有降低的趋势,其中ΦPSⅡ和Fv/Fm有显著性差异(P<0.05),预先接种有菌根真菌GV的处理组的丹参叶片ΦPSⅡ、Fv/Fm、qP和qN参数相比较于只接种病原菌处理有升高的趋势,但只有ΦPSⅡ有显著性差异。叶绿素含量：接种病原菌后10d,叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量均显著降低(P<0.05)。在接种有病原菌的条件下,接种有菌根GV的处理组丹参叶片叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量均显著高于未接种菌根GV处理组(P<0.05)。表明病原菌的作用会导致丹参叶中叶绿素合成减少,从而降低光合作用,影响植株生长,而菌根真菌G.versiforme能显著缓和由病原菌引起的负面作用。可溶性糖含量：菌根处理组植株叶片可溶性糖含量显著高于非菌根处理(P<0.05),接种有G. versiforme和病原菌PC处理组可溶性糖含量较单接种G.versiforme处理组或单接中病原菌PC处理组都有显著提高(P<0.05)。表明接种菌根真菌G.versiforme能够促进植株叶片可溶性糖含量的积累。防御酶活性：无论接种AM真菌,还是病原菌都明显提高了根内PAL和p-1,3葡聚糖酶的活性(P<0.05)。而双接种AM真菌和病原菌,可使PAL、几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶酶活性显著高于单接种病原菌处理(P<0.05)。表明AM真菌具有在一定范围内激活丹参植株与抗病有关防御酶类反应的效应。蛋白质含量：经病原菌处理的丹参植株NM+和GV+组叶中蛋白质含量相对于无病原菌处理组略有降低(P>0.05),NM+组根中蛋白质含量显著降低(P<0.05),GV+组根中蛋白质含量显著升高(P<0.05)。接种菌根真菌和病原菌处理蛋白质含量始终高于单接种病原菌处理组,只是在根中差异显著,叶中不显著。表明病原菌处理后,菌根真菌G. versiforme能够显著促进丹参根中蛋白质的合成。病程相关蛋白基因和防卫基因：荧光定量PCR检测表明,接种菌根真菌或、和病原菌的丹参植株3d后,根系病程相关蛋白基因PR10和防卫基因PDF2.1都被诱导表达了,其中只接种菌根真菌处理组的PR10和PDF2.1基因表达量显著高于不接菌对照(P<0.05)。接种有菌根真菌和病原菌PC的处理组PR10和PDF2.1基因表达量显著高于只接种病原菌PC处理(P<0.05)。结论1、山东莱芜丹参种植基地的丹参根部病害是由轮枝孢属(Verticillium)的大丽轮枝菌(Verticillium dahlia, VD)和镰刀菌属(Fusarium)尖孢镰刀菌的专化型黄瓜枯萎病菌(Plectosphaerella cucumerina, PC)所引起的真菌性植物病害。2、分离得到的两种病原菌对丹参幼苗的致病性不同,其中黄瓜枯萎病菌致病性强于大丽轮枝菌。两种病菌处理均能显著提高丹参植株内与防御相关的酶活性,以及与水杨酸途径相关的病程相关蛋白基因PR10和与茉莉酸途径相的基因PDF2.1的相对表达量。同时生理生化方面的研究明黄瓜枯萎病菌变化程度大于大丽轮枝菌。3、AM真菌摩西球囊霉(Glomus mosseae, GM)、地表球囊霉(Glomus versiforme, GV)、根内球囊霉(Glomus intraradices, GI)均能促进丹参的生长和有效成分含量的增加,其中以G.versiforme的改善效果最好。4、AM真菌G.versiforme能显著降低丹参根部病害发病率和病情指数,缓解丹参根部病害的发生,其抗病作用主要通过促进光合作用,提高叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白含量,防御酶活性以及病程相关蛋白和防卫基因的表达,从而提高寄主植物的抗病性。由于丛枝菌根真菌可与80%以上的高等植物形成共生关系,形成的菌根有多种功能,这种共生关系在自然界中能自然形成,且十分稳定,因此菌根真菌诱发宿主植物的抗病机理将为利用有益微生物菌根真菌进行病害的生物防治提供理论基础。