目的和意义:急性髓细胞白血病（AML）是一种高度侵袭性的血液恶性肿瘤,其发生发展与某些基因改变密切相关。其中的FLT3-ITD突变是AML中的常见突变,伴有该突变的患者预后不良。近年来,人们致力于开发FLT3酪氨酸激酶抑制剂,但单药使用效果有限,因而尝试FLT3抑制剂联合其他种类药物的应用。本研究着眼于伴FLT3-ITD突变AML的药物联合治疗,探讨FLT3抑制剂ASP2215联合HDAC抑制剂SAHA作用FLT3-ITD突变细胞株的药物协同性及协同作用机制,为将来这两类药物联合治疗FLT3-ITD突变AML提供理论基础。方法:以不同浓度的ASP2215、SAHA单药或两药联合处理伴FLT3-ITD突变的MV4-11细胞株,CCK-8法检测细胞活性,细胞甩片后瑞氏染色观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,蛋白免疫印迹检测FLT3及下游分子STAT5的磷酸化水平,凋亡相关蛋白caspase-3/9,Mcl-1,Bcl-xL,Bcl-2和Bax以及周期相关蛋白cyclin D1、CDK 6和P27^Kip1蛋白的表达水平,使用实时定量PCR技术检测cyclin D1、CDK 6和P27^Kip1基因mRNA转录水平。结果:⑴相较于FLT3未突变细胞株THP-1,ASP2215能够特异性地抑制FLT3-ITD突变AML细胞株MV4-11细胞的增殖,显示出良好的作用效果。⑵ASP2215和SAHA单药均能抑制MV4-11细胞的活性,这种抑制作用呈现浓度和时间依赖性;并且两药联合抑制细胞株的活性更强,呈协同作用。⑶FLT3抑制剂ASP2215能够降低FLT3受体及下游分子STAT5的磷酸化水平,SAHA对FLT3及下游STAT5分子磷酸化也有轻度抑制作用,两药联合相较单药降低FLT3和STAT5的磷酸化水平更明显。⑷ASP2215和SAHA呈浓度和时间依赖性诱导MV4-11细胞凋亡,两者联合对MV4-11细胞凋亡有协同作用。凋亡过程伴caspase-3和caspase-9蛋白剪切活化,活化程度随细胞凋亡增加而上升。相较于单药作用,两药联合caspase-3和caspase-9剪切活化更显著。形态学上,细胞凋亡和坏死改变随着药物浓度增加依次增多,并且两药联合能够引起细胞更明显的凋亡和坏死改变。ASP2215和SAHA都能够呈浓度依赖性引起Mcl-1和Bcl-xL抗凋亡蛋白水平的降低,且SAHA能够引起Bcl-2蛋白水平的减低,ASP2215对其影响不大;促凋亡蛋白Bax的水平只随着ASP2215或SAHA单药药物浓度的增加轻度上升。两药联合相较于单药能够进一步下调Mcl-1,Bcl-xL的蛋白表达水平和Bcl-2/Bax蛋白比例。⑸两药联合相较于单药能够明显增加细胞凋亡和细胞G1期阻滞。FLT3抑制剂ASP2215和HDAC抑制剂SAHA都能够引起CDK抑制蛋白P27^KIP1表达水平的上调,并且两药联合能够引起P27^Kip1蛋白水平进一步增加。与此相反,ASP2215和SAHA能够下调周期蛋白cyclin D1的表达水平,两药联合能够进一步引起cyclin D1基因在转录水平和翻译水平的下调。周期依赖性激酶CDK 6的表达只被ASP2215所抑制,ASP2215与SAHA两药联合对CDK 6的作用效果与ASP2215单药作用相当。结论:⑴FLT3抑制剂ASP2215与HDAC抑制剂SAHA联合对伴有FLT3-ITD突变细胞株MV4-11的细胞活性具有协同抑制作用,协同机制涉及ASP2215和SAHA共同抑制FLT3-STAT5信号转导通路。⑵FLT3抑制剂ASP2215联合HDAC抑制剂SAHA能够协同诱导FLT3-ITD突变细胞株MV4-11细胞凋亡,伴随caspase-3和caspase-9活化增加。且两药联合协同诱导凋亡作用能够协同下调凋亡相关蛋白Mcl-1、Bcl-xL和Bcl-2/Bax比率的水平。⑶FLT3抑制剂ASP2215和HDAC抑制剂SAHA能够协同阻滞MV4-11细胞于G1期,作用机制涉及两药对CDK抑制蛋白P27^Kip1、周期蛋白依赖性激酶CDK 6和周期蛋白cyclin D1的共同作用。两药联合相较于单药能够进一步引起P27^Kip1基因mRNA水平和蛋白水平的上调和cyclin D1基因mRNA水平和蛋白水平的下调;CDK 6基因表达只被FLT3抑制剂ASP2215下调。