降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide，CGRP）被证实可以促进成骨细胞的增殖和分化活性，已知的CGRP信号调控通路包括了：胞内钙离子通道（Ca2+）、环磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶（PKC）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、胞外信号调节激酶（ERK）等。大量实验证实，骨形态发生蛋白（BMP）也同样拥有诱导成骨的能力。骨髓基质细胞在有BMP-2参与的基础上，通过旁分泌和自分泌作用，在细胞和细胞间质传导信息，刺激DNA的合成和细胞的复制，促进成骨细胞前体的增殖，诱导未分化间充质细胞不可逆地分化为软骨细胞和成骨细胞，提高干细胞的成骨表型和成骨能力，增强碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）的活性，促进细胞间的粘附和成骨细胞标记基因的表达。目前已知的BMP对成骨细胞的信号传导主要包括有Smad，P38MAPK通路。目前的研究发现：BMP-2，4，6可以促进神经分泌CGRP，CGRP在体外促进牙髓细胞分泌BMP-2，BMP-2体内异位诱导成骨组织中CGRP的神经可以再生分布，BMP-2在腹腔注射CGRP的大鼠胫骨骨折愈合的骨痂中高表达，CGRP在体外协同增加BMP-2诱导成骨细胞增殖的能力。这些研究结果提示：CGRP可以诱导骨组织中BMP-2的表达增加，但两者之间相互作用的信号通路机制目前尚不清楚，因此推测CGRP的促成骨作用可能与BMP-2的表达有相关性。本实验将对CGRP促成骨细胞增殖、分化作用中BMP信号通路所发挥的作用；CGRP促成骨细胞BMP-2表达的影响及其机制等进行研究。方法1．细胞培养：人骨肉瘤细胞（MG63）细胞株（中国科学院上海生命科学研究院）接种于培养瓶（100ml）中传代培养（5×106个/cm²），培养基为RPMI1640（含10%FBS），放置于5%CO2孵箱中37°C孵育72h传代，传代至6-7代时使用。2．CGRP对MG63细胞增殖和分化的调控作用：2.1MG63细胞增殖：MTT法检测CGRP对MG63细胞增殖的调控作用；流式细胞仪检测CGRP对MG63细胞增殖周期的调控。设定量效作用的浓度为(10^–10-10^–7M)，时效作用为（24-72h）。2.2MG63细胞分化：PNPP偶氮法检测CGRP对MG63细胞ALP染色的调控作用；Western blot检测CGRP对MG63细胞碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）、骨钙素（OCN）表达的调控作用。设定量效作用的浓度为(10^-10-10^-7M)，时效作用为（24-72h）。免疫荧光染色检测10-8M CGRP对MG63（48h）ALP表达的作用。3．CGRP对MG63细胞增殖、分化调控中BMP信号通路的作用：3.1分组：10-8M CGRP；10-8M CGRP+100ng/ml Noggin；100ng/ml Noggin；空白对照组，作用时间为48h。3.2MG63细胞增殖影响：流式细胞仪检测MG63细胞增殖周期。3.3MG63细胞分化影响：免疫荧光染色检测MG63细胞的ALP表达；Western blot检测MG63细胞的ALP，ColIaⅠ和OCN蛋白表达。4．CGRP对MG63细胞表达BMP-2的调控作用：4.1RT-PCR检测CGRP对MG63细胞表达BMP-2mRNA的调控作用：设定量效作用的浓度为(10^-10-10^-7M)，时效作用为（1-48h）。4.2CGRP促进MG63细胞表达BMP-2中Noggin的作用：分组：10-8M CGRP；10-8M CGRP+100ng/ml Noggin；100ng/ml Noggin；空白对照组，作用时间48h。RT-PCR检测MG63细胞BMP-2mRNA的表达；Western blot检测MG63细胞BMP-2蛋白的表达。5．CGRP促进MG63细胞表达BMP-2的机制：5.1分组：10-8M CGRP、10-8M CGRP+5μM H-89、5μM H-89、空白对照组，作用时间48h。5.2免疫检测试剂盒检测MG63细胞cAMP表达；RT-PCR检测MG63细胞BMP-2mRNA表达；Western blot检测MG63细胞BMP-2、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMPresponse element binding protein， CREB）、磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（Phosphorylated Camp Response Element Binding Protein，pCREB）的表达。6．统计分析：所有数据均采用均数±标准差（±s）表示，应用Dunnett，s检验中的t检验和方差分析，进行统计分析，分别设定p<0.05以及p<0.01表明有显著性差异和差异非常显著。结果1．CGRP对MG63细胞增殖、分化的调控作用：1.1MG63细胞增殖：MTT法检测发现CGRP加入MG63细胞培养基中24-72h的时间段中，CGRP各浓度组的细胞数均显著高于空白对照组（P<0.05），其中以10-8MCGRP浓度组最为明显（P<0.05）；流式细胞仪检测细胞增殖周期发现不同浓度的CGRP都加速了细胞周期循环，但是以48h10-8M组最为明显（P<0.05），48h以后有下降趋势。1.2MG63细胞分化：PNPP偶氮法检测发现各浓度组的CGRP促进MG63细胞的ALP表达量均高于空白对照组，其中以72h10-8M组最为明显（P<0.05），时效对比中发现各浓度组细胞的ALP表达量在72h较48h增加不明显（P＞0.05）；蛋白定量分析结果发现各实验组的ALP，ColIaⅠ和OCN蛋白表达量均高于空白对照组（P<0.05），其中以48h10-8M组最为明显（P<0.05）；免疫荧光染色结果发现48h10-8M组荧光数目较空白对照组多。2．CGRP对MG63细胞增殖、分化调控中BMP信号通路的作用：2.1MG63细胞增殖：流式细胞仪检测发现CGRP组和CGRP+Noggin组的S+G2期细胞的数目高于空白对照组（p<0.05），但是CGRP组和CGRP+Noggin组之间没有明显差异。2.2MG63细胞分化：Wstern-blot检测CGRP组ALP，ColIaⅠ和OCN蛋白的表达量高于空白对照组（p<0.05）；CGRP+Noggin组低于CGRP组（p<0.05）。3．CGRP对MG63细胞表达BMP-2的调控作用：3.1PCR检测发现8-24小时内只有10-8M、10-7M组可以检测到BMP-2mRNA的表达，且10-7M组明显高于10-8M组（p<0.01）；48h10-9M组可检测到BMP-2mRNA表达，但明显低于48h10-8M、48h10-7M两组（p<0.01）。3.210-8M CGRP作用48h，MG63细胞BMP-2mRNA和蛋白的表达量，CGRP组高于空白对照组和Noggin组（P<0.01），CGRP+Noggin组与CGRP组无差异。4．CGRP促进MG63细胞表达BMP-2的机制：4.1MG63细胞cAMP含量检测发现，CGRP组和CGRP+H-89组均高于空白对照组（P<0.01），但是前两组之间无显著差异。4.2CGRP、CGRP+H-89、H-89和空白对照组的CREB表达量无显著差异。4.3CGRP组的pCREB蛋白表达量高于空白对照组（P<0.01），但是CGRP+H-89组明显低于CGRP组（P<0.01）。4.4CGRP组的BMP-2mRNA和蛋白表达量高于空白对照组（P<0.01），但是CGRP+H-89组明显低于CGRP组（P<0.01）。结论1．CGRP促进MG63细胞的增殖与分化，并且具有时间以及剂量依赖性，优势浓度为10-8M，优势时段为48h。2．CGRP可能通过BMP-2途径促进MG63细胞的分化，而不通过BMP-2途径促进MG63细胞的增殖。3．CGRP促进MG63细胞表达BMP-2，并且具有时间以及剂量依赖性，优势浓度为10-7M，优势时段为48h。4．CGRP促进MG63细胞BMP-2表达的可能机制是：通过CGRP促进cAMP合成，从而促进CREB磷酸化，进而促进BMP-2转录。