骨肉瘤(oseteosarcoma,OS)是一种常见于儿童和青少年的原发性,高度恶性骨肿瘤,也是骨科最为常见的恶性肿瘤。骨肉瘤好发于长骨干骺端,尤其是胫骨近端近膝关节。据美国癌症中心SEER数据库统计,骨肉瘤发病率逐年提高,在过去10年间,每年约增长0.3%。然而自上世纪60年代MAP化疗方案与新辅助化疗问世后,新辅助化疗联合手术治疗就始终是骨肉瘤的首选治疗方案,此后的30余年中,骨肉瘤的治疗始终未见明显的突破性进展。OS的总体治疗效果仍较差,患者的长期无瘤生存与总体生存率仍然很低。骨肉瘤具备高度异质性,同时易并发早期远处转移,尤其是广泛的肺转移,通常是造成骨肉瘤患者死亡的重要原因之一。骨肉瘤也因此成为一种极度威胁人类健康,特别是儿童健康的疾病。针对骨肉瘤治疗进行更为深入的靶向药物研究十分必要。LKB1是一个经典的肿瘤抑制基因,最早被发现与黑斑息肉综合征(Peutz-Jeghers syndrome,PJS)有密切关联1,而PJS是一种组织器官泛发息肉样变为特征的疾病,PJS患者的肿瘤发生率是普通人群的10～18倍2,与包括消化道肿瘤、肺、乳腺、子宫、前列腺、卵巢、睾丸和胰腺等的肿瘤均有密切关联3。在多种肿瘤中可检测到LKB1基因的突变或缺失,LKB1的突变或缺失通过降低LKB1蛋白的激酶活性或减少LKB1激酶表达,而使得细胞生长失控,导致肿瘤的发生4。LKB1可与细胞内多种信号通路与生物功能密切相关,包括细胞能量代谢的调节、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡以及细胞极性调控等5。研究表明外源性过表达LKB1基因可导致p21蛋白表达的增加,阻滞细胞周期于G1期6。LKB1为AMPK通路的上游激酶,对肿瘤代谢与微环境调节至关重要。而同时,最新研究表明,LKB1参与了肿瘤的免疫调控,包括调节T-reg细胞分化7,8、调节PD-L1受体表达与降解等9-11。LKB1在肿瘤治疗中具备多种方向的潜能。而在骨肉瘤领域,已有研究表明激活AMPK通路可抑制骨肉瘤增殖,虽然尚无靶向LKB1抑制骨肉瘤的相关研究。同时最近中科院上海生化所邹卫国研究组的研究结果表明,在CTSK阳性细胞中敲除抑癌基因LKB1以后,活体实验发现小鼠发生类似人类骨肉瘤的组织表现。进一步表明LKB1基因在骨肉瘤的起源于发展过程中潜在具有重要作用。但LKB1在骨肉瘤中的表达,以及关于靶向LKB1来抑制骨肉瘤的研究目前未见报道。基于以上原因,本研究拟通过生物信息结合组织芯片研究,明确LKB1基因在骨肉瘤组织和细胞系中的表达。通过LKB1过表达探讨其对活体骨肉瘤增殖的影响。进一步对骨肉瘤中LKB1的转录因子进行预测,进行通过转录因子干预而过表达LKB1的可行性。并通过体内外实验探讨药物干预靶向LKB1抑制骨肉瘤增殖侵袭的可行性。本研究包括4个部分:(1)LKB1在人骨肉瘤组织标本与健康骨组织标本,以及骨肉瘤细胞株与健康对照细胞株中的表达情况;(2)过表达LKB1基因构建稳转细胞系,明确LKB1在活体异种移植骨肉瘤模型中对骨肉瘤增殖的影响;(3)通过转录因子预测结合共表达分析进行LKB1在骨肉瘤中的转录因子预测,并进行LKB1转录因子(RXRA)的药物(Bexarotene)干预,验证蛋白水平体外药物干预过表达LKB1的可行性;(4)通过体外Bexarotene药物干预,探讨Bexarotene对体外骨肉瘤细胞株增殖侵袭的影响;同时通过构建免疫缺陷裸鼠骨肉瘤异种移植模型,探讨Bexarotene给药对活体骨肉瘤增殖的影响。第一章LKB1在人骨肉瘤组织中的表达情况及过表达LKB1对活体骨肉瘤增殖能力的影响目的:探索LKB1基因与蛋白在骨肉瘤和正常骨组织中的表达情况,以及LKB1基因在小鼠骨肉瘤异种移植模型中对骨肉瘤增殖侵袭能力的影响。方法:通过公开数据集进行骨肉瘤与健康骨组织转录组数据分析,探讨基因水平LKB1在骨肉瘤中的表达情况。通过组织芯片免疫组织化学染色,探讨蛋白水平LKB1基因在骨肉瘤中的表达状况。此后选择人骨肉瘤细胞M-HOS细胞系,通过慢病毒载体构建LKB1过表达细胞系(LKB1 OE组)和空载体转染的细胞系(NC组),并通过嘌呤霉素筛选获取稳转细胞株。通过免疫荧光和Western blot法检测慢病毒载体对人骨肉瘤细胞LKB1基因的过表达效果。最后,取10只BALB/c裸鼠进行活体成瘤的体内实验,选择稳定转染的HOS-LKB1 OE和HOS-NC细胞经胫骨原位种植成瘤(n=5),明确LKB1基因在体内对人骨肉瘤细胞生物学行为的影响。结果:通过公开数据集E-MEXP-3628、GSE12865、GSE42352进行生物信息学分析,结果显示LKB1基因在骨肉瘤组织中的表达显著低于正常骨组织以及成骨细胞、间充质干细胞。通过免疫组织化学法染色及评分,统计LKB1及其活性形式p-LKB1在组织芯片中的阳性与强阳性率(++与+++),结果显示LKB1在人骨肉瘤芯片中阳性与强阳性表达率为12.5%(5/40),在正常骨组织中阳性与强阳性表达率为 63.7%(7/12)(P<0.05)。HOS细胞系稳定转染LKB1基因和空载体后,Western blot检测LKB OE组LKB1蛋白表达量显著增强;蛋白免疫荧光检测LKB1组细胞荧光强度明显高于NC组。裸鼠胫骨原位成瘤模型显示:5周后,LKB1组胫骨肿瘤体积较NC组瘤体积更小(P<0.05)。结论:在骨肉瘤中,LKB1在基因水平与蛋白水平均呈现显著低表达。活体LKB1基因过表达抑制活异种移植的裸鼠骨肉瘤模型肿瘤细胞的生长增殖能力。第二章 LKB1基因在骨肉瘤中的转录因子预测、靶向药物筛选与体外验证目的:探索通过转录因子途径进行体外药物干预,从而过表达LKB1蛋白的可能性。方法:通过GEO公共数据集进行基因共表达关联分析,通过NCBI获取LKB1启动子区域,通过PROMO获取可与LKB1启动子位点结合的转录因子列表,结合共表达关联分析与转录因子列表及文献分析获取可疑转录因子及其激活剂。通过HOS、U2细胞株进行体外实验,研究该激活剂在体外实验中对上调LKB1表达的作用。结果:GEO共表达分析显示4061基因与LKB1呈现显著的共表达关联。通过NCBI获取了 LKB1的转录因子序列,匹配结果显示51个转录因子在LKB1启动子序列中存在结合位点。其中RXRA与LKB1的共表达关联最为显著,且可结合于LKB1启动子。文献分析显示RXRA可激活LKB1表达,且存在特异性激活剂Bexarotene。进行Bexarotene干预实验,免疫荧光与Western blot法检测发现:Bexarotene干预组与对照组相比,LKB1与p-LKB1显著表达上调。结论:在骨肉瘤中RXRA很可能是LKB1的转录因子之一,药物激活RXRA受体体外可增加LKB1蛋白表达。第三章 Bexarotene在体外和体内对人骨肉瘤增殖侵袭的影响目的:探索体外Bexarotene干预下,骨肉瘤增值侵袭能力的变化情况。探索活体Bexarotene干预下,小鼠骨肉瘤异种移植模型中对骨肉瘤增殖能力的影响。方法:体外实验采用骨肉瘤HOS、U2细胞株,分为Bexarotene给药组(BEX组)与对照组(NC组)。通过CCK8实验进行细胞活力检测。通过克隆成型实验进行细胞克隆成型能力检测。通过TransWell实验进行细胞侵袭能力检测。体内实验选择人骨肉瘤细胞M-HOS细胞系,通过慢病毒载体构建荧光素酶过表达细胞系(HOS-L)。通过活体胫骨近端原位成瘤手术构建BALB/c裸鼠原位异种移植骨肉瘤模型。通过Bexarotene香油混悬液口服(BEX组)与食用香油口服(NC组)施加干预,观察Bexarotene对骨肉瘤生长增殖的影响。1)通过慢病毒转染结合嘌呤霉素进行荧光素酶过表达稳转细胞株的构建和筛选。2)取10只BALB/c裸鼠进行体内实验,选择稳定转染的HOS-L细胞经胫骨原位种植成瘤(n=5)明确LKB1基因在体内对人骨肉瘤细胞生物学行为的影响。3)活体荧光结合标本切取检测骨肉瘤增殖效率。4)免疫组化检测增殖相关指标的表达。结果:体外实验CCK8实验显示Bexarotene显著抑制骨肉瘤细胞增殖。克隆成型实验显示Bexarotene显著抑制骨肉瘤细胞增殖。TransWell实验结果显示Bexarotene抑制体外骨肉瘤细胞侵袭能力。体外实验通过构建荧光报告基因稳转细胞株HOS-L进行骨肉瘤原位成瘤模型构建6周后,BEX组胫骨肿瘤体积较NC组瘤体积减小,差异有统计学意义(p=0.0373);裸鼠肿瘤标本免疫组化染色提示,PCNA、KI67增殖指标显著降低,LKB1表达提高。结论:Bexarotene体外显示骨肉瘤抑制作用。Bexarotene可上调骨肉瘤组织中LKB1的表达,并下调PCNA、KI67的表达,可以影响活异种移植的裸鼠骨肉瘤模型肿瘤细胞的生长增殖能力,部分抑制活体骨肉瘤增殖。