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母猪的繁殖力受卵泡生长发育与闭锁的影响,并因此影响养猪的经济效益。卵巢上绝大多数卵泡因闭锁退化不能排卵,这是导致遗传资源浪费的主要原因。卵巢卵泡的发育与闭锁受多种因子影响,但具体的调控机制尚未明确。雌激素受体β(ERβ)作为卵泡发育的重要转录因子之一,主要通过实现雌激素的功能以调控颗粒细胞的存活、增殖和分化。鉴于ERβ在卵巢上的表达特性,结合ERβ调控人类不同细胞的自噬功能,暗示ERβ可能诱导细胞自噬,引发卵泡闭锁。最初认为PHB2作为雌激素受体活性抑制剂(REA),和雌激素受体α(ERα)结合,并在E2存在下抑制ERα特异性调控的基因转录,近年来发现PHB2具有ERβ结合位点,但具体调控机制尚不清楚。本试验以猪卵巢颗粒细胞(GCs)为研究对象,研究ERβ与PHB2对GCs自噬的影响,并探究AKT/m TOR信号通路在该过程中的作用,获得了以下结果:1.本试验分别于小(<2mm)、中(2-6mm)、大(>6mm)三种类型的卵泡中分离到GCs检测其凋亡与自噬情况。结果表明,与小卵泡相比,中卵泡的GCs增殖率较高,大卵泡的GCs增殖率较低(P<0.05)。大卵泡的GCs中Bax和Caspase3 m RNA水平显著升高(P<0.05),但Bcl-2/Bax比值较低。中卵泡中自噬标记基因ATG3、ATG7和LC3 m RNA水平较高。凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白的表达水平与m RNA表达水平相似。大卵泡的GCs中ERK磷酸化水平显著高于中卵泡与小卵泡(P<0.05),而中卵泡的GCs中AKT和m TOR的磷酸化水平显著高于大卵泡与小卵泡(P<0.05)。DAPI和MDC的荧光标记证实了不同卵泡大小的GCs中基因转录和蛋白表达的结果。由以上结果可知,在卵泡发育过程中,不同大小的卵泡中均发生自噬和凋亡,其中自噬主要发生在中卵泡的GCs中,凋亡主要发生在大卵泡的GCs中。2.本试验构建ERβ过表达载体并转染GCs,利用实时荧光定量PCR与Western blot技术检测自噬相关基因与蛋白的表达,试验结果表明过表达ERβ的GCs自噬相关基因ATG3、BECN、LC3及其蛋白的表达均显著高于对照组(P<0.05),而沉默ERβ的GCs自噬相关基因ATG3、BECN、LC3的表达显著低于对照组(P<0.05),沉默ERβ的GCs自噬相关蛋白ATG3、BECN的表达显著低于对照组(P<0.05)。以上研究结果表明,ERβ对GCs自噬有调控作用。由于ERβ在卵巢闭锁卵泡和生长后期卵泡中的高表达,表明了ERβ在诱导卵泡闭锁过程中起重要作用。3.为了研究PHB2对GCs自噬的调控作用,本试验构建PHB2过表达载体并转染GCs,测定了ATG3、BECN和LC3 m RNA表达水平和蛋白表达水平,结果表明,在过表达PHB2的GCs中,ATG3、BECN与LC3的m RNA水平与蛋白水平显著高于对照组GCs(P<0.05)。同时,沉默PHB2的GCs中,ATG3、BECN与LC3的m RNA水平与蛋白水平显著低于对照组GCs(P<0.05)。以上研究结果表明,PHB2对GCs自噬有调控作用,过表达PHB2诱导GCs自噬,沉默PHB2可抑制GCs自噬的发生。4.为了研究ERβ与PHB2是否存在相互作用,本试验在293A细胞中共转染PMCHEERY-N1-ERβ与PEGFP-N1-PHB2过表达载体,免疫共沉淀试验结果表明ERβ与PHB2结合形成蛋白复合物。同时,利用激光共聚焦技术证明ERβ与PHB2在GCs中存在共定位。此外,为了进一步确认ERβ与PHB2形成的蛋白复合物是否能够诱导GCs自噬,试验在过表达ERβ的同时沉默PHB2,结果表明在共转染ERβ过表达载体与si-PHB2的GCs中,ATG3、BECN与LC3的m RNA水平与蛋白水平与空白组相比差异不显著(P>0.05);共转染PHB2过表达载体与si-ERβ的GCs中,ATG3、BECN与LC3的m RNA水平与蛋白水平与空白组相比差异不显著(P>0.05)。试验结果证实了在GCs中沉默PHB2可以部分挽救由过表达ERβ引起的细胞自噬;在GCs中沉默ERβ可以部分挽救由过表达PHB2引起的细胞自噬。由此可见,ERβ与PHB2在细胞中形成蛋白复合物进而诱导GCs自噬,且在缺失ERβ或PHB2时无法引起自噬。5.为了探究AKT/m TOR信号通路在ERβ与PHB2诱导GCs自噬过程中的作用,本试验在GCs中转染了ERβ过表达载体及PHB2过表达载体,研究结果表明过表达ERβ或PHB2会引起m TOR磷酸化水平降低(P<0.05),进而诱导细胞自噬;沉默ERβ或PHB2会使m TOR磷酸化水平升高(P<0.05),进而抑制细胞自噬。为了验证是否是ERβ与PHB2形成的蛋白复合物通过m TOR信号通路诱导细胞自噬,本试验在过表达ERβ的同时沉默PHB2,结果表明在共转染ERβ过表达载体与si-PHB2的GCs中,m TOR的磷酸化水平与空白组相比差异不显著(P>0.05);同样,在共转染PHB2过表达载体与si-ERβ的GCs中,m TOR的磷酸化水平与空白组相比差异不显著(P>0.05)。研究结果表明沉默PHB2抑制过表达ERβ引发的m TOR磷酸化水平降低,沉默ERβ抑制过表达PHB2引发的细胞自噬。试验表明,ERβ与PHB2在细胞中形成蛋白复合物通过AKT/m TOR信号通路进而诱导GCs自噬,且在缺失ERβ或PHB2时无法引起自噬。综上所述,在卵泡的发育过程中,中型卵泡中的GCs更易发生自噬,大型卵泡的GCs更易发生凋亡;ERβ通过与PHB2在细胞内结合,形成的蛋白复合物通过m TOR信号通路诱导GCs自噬。由于ERβ在卵巢闭锁卵泡和生长后期卵泡中的高表达,表明了ERβ在诱导卵泡闭锁过程中起重要作用,研究结果为进一步揭示ERβ调控卵泡发育与闭锁的机制提供理论支撑。