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目的：研究表明脑缺血时神经元及胶质神经细胞多种信号转导途径被激活,如MAPK信号转导通路,PI3K/Akt信号转导通路,JAK/SATA信号转导通路,NF-κB转录因子参与的信号通路,蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信号转导通路等。近来研究发现mTOR信号转导通路与多种神经疾病有关,如癫痫,中风,但是具体机制仍不明确。mTOR信号转导通路在细胞生长与存活中发挥着至关重要的作用。一些证据支持mTOR具有神经损伤作用,而另外一些证据则表明mTOR具有神经保护作用。PI3K-Akt-mTOR信号转导通路为mTOR上游最常见信号通路,研究指出ASIC1a阻断剂能够提高提高PI3K/Akt信号通路活化程度,也有研究表明,p-AKT活化水平也可以调节ASIC1a的表达,提示mTOR与ASICs可能有一定相关性。本研究通过体外培养离体大鼠大脑皮质皮层神经元,建立缺氧缺血/再灌注(OGD/R)损伤模型和酸损伤模型,模拟脑缺血损伤,通过MTT法,Hoechst33258荧光染色法,Western blot等方法探讨mTOR在脑缺血损伤中的作用及机制以及mTOR与ASICs是否具有一定相关性。
方法：⑴新生24小时内大鼠大脑皮质皮层神经元原代培养,阿糖胞苷抑制非神经元的生长；⑵建立离体皮层神经元OGD/R损伤模型和酸损伤模型；⑶设立阿米洛利(10μmol/l)阳性对照组、正常对照组、(+)儿茶素0.25、0.5、1mmol/L药物处理组,OGD/R模型损伤组,采用Hoechst33258染色神经元凋亡；⑷mTOR在脑缺血中的作用及ASICs阻断剂对其的影响：设立正常对照组,0.02、0.2、1、5、10、25、50、100 nmol/L雷帕霉素药物处理组,OGD/R模型损伤组与酸损伤模型组,形态学观察比较,MTT比色法检测各组细胞存活率；设立正常对照组、OGD/R模型损伤组与酸损伤模型组,100nmol/L雷帕霉素对照组,10,100μmol/阿米洛利药物处理组,1mmol/L儿茶素药物处理组。Western blot测mTOR下游,p-p70S6 K,p-4e-bp1蛋白的表达。
结果：①OGD/R再灌注24h,神经元Hoechst33258染色。各组细胞凋亡率如下:正常组(6.58±1.78),模型组(33.88±1.73),amiloridum组(17.8±2.87),(+)-catechin1mmol/L组(18.55±1.73),(+)-catechin0.5mmol/L组(19.42±0.092),(+)-catechin0.25mmol/L组(28.65±1.47)。与正常组相比,模型组与药物处理组皮层神经元凋亡数明显增加(P＜0.01);与模型组相比,amiloridum与(+)-catechinl,0.5 mmol/L药物处理组神经元凋亡数降低(P＜0.05),与amiloridum组相比(+)-catechin0.25mmol/L组皮层神经元凋亡数明显增加(P＜0.05)。②经氧糖剥夺再恢复(OGD/R)损伤皮层神经元,各组的细胞存活率如下:正常组(100.00±0.00),模型组(65.67±3.25),100 nmol/LPAPA处理组(71.97±4.47),50 nmol/L处理组(70.05±3.64),25 nmol/LPAPA处理组(73.59±1.52),10nmol/LPAPA处理组(79.87±2.74),5 nmol/LPAPA组(80.36±3.10),1nmol/LPAPA处理组(81.02±2.86),0.2 nmol/LPAPA处理组(79.71±4.64),0.02nmol/LPAPA组(78.18±9.34)。与正常组相比,RAPA药物组和模型组皮层神经元存活率明显下降(P＜0.01);与模型组相比,RAPA各组神经元存活率均显著提高(P＜0.05);RAPA各组神经元存活率有显著的差异,小于10nmol/L RAPA药物处理组,明显高于RAPA大剂量组(P＜0.05),且各组无显著差异(P＞0.05)。③经酸损伤损伤皮层神经元,各组的细胞存活率如下:正常组(100.00±0.00),模型组(64.25±5.06),100 nmol/LPAPA处理组(79.07±3.44).50nmol/L处理组(78.86±2.91),25 nmol/LPAPA处理组(78.77±4.12),10nmol/LPAPA处理组(77.07±1.51),5 nmol/LPAPA组(67.64±4.56),1nmol/LPAPA处理组(72.24±1.57),0.2 nmol/LPAPA处理组(72.52±2.05),0.02nmol/LPAPA组(67.18±8.11)。与正常组相比,RAPA药物组和模型组皮层神经元存活率明显下降(P＜0.01);与模型组相比,RAPA各组神经元存活率均显著提高(P＜0.05);RAPA各组神经元存活率有显著的差异,大于10nmol/L RAPA药物处理组,明显高于RAPA小剂量组(P＜0.05),且各组无显著差异(P＞0.05)。④OGD/R损伤细胞p-p70S6K的表达:与正常组相比,模型组p-p70S6K的表达量显著升高(P＜0.01),药物处理组显著降低(P＜0.01);与模型组相比,药物处理组p-p70S6K的表达量显著降低(P＜0.01);与雷帕霉素组相比,10,100μmol/L阿米洛利组p-p70S6K的表达量均显著升高(P＜0.01);儿茶素组高于10μmol/L阿米洛利组(P＜0.01),但低于100μmol/L阿米洛利组(P＜0.01)。⑤OGD/R损伤细胞p-4e-bp1的表达:与正常组相比,模型组,100μmol/L阿米洛利组和儿茶素组p-4e-bp1表达显著升高(P＜0.01);与模型组相比,药物处理组p-4e-bp1表达显著降低(P＜0.01);与雷帕霉素组相比,100μmol/L阿米洛利组和儿茶素组p-4e-bp1表达显著升高(P＜0.01),10μmol/L阿米洛利组显著降低(P＜0.01);100μmol/L阿米洛利组p-4e-bp1表达显著高于儿茶素组(P＜0.01)。⑥酸损伤细胞p-p70S6K的表达:与正常组相比,儿茶素组与雷帕霉素组p-p70S6K的表达量显著升高(P＜0.01),100μmol/L阿米洛利组表达升高(P＜0.05);与模型组相比,儿茶素组与雷帕霉素组p-p70S6K的表达量显著升高(P＜0.01);与雷帕霉素组相比,10μmol/L阿米洛利组p-p70S6K的表达量显著显著降低(P＜0.01);100μmol/L阿米洛利组显著高于10μmol/L阿米洛利组(P＜0.01),略低于儿茶素组(P＜0.05);儿茶素组与雷帕霉素组p-p70S6K的表达量无显著性差异。⑦酸损伤细胞p-4e-bp1的表达：与正常组相比,模型组与药物组p-4e-bp1表达显著升高(P＜0.01),与模型组相比,给药组p-4e-bp1表达显著升高(P＜0.01);与雷帕霉素组相比,100μmol/L阿米洛利组显著升高(P＜0.01),10μmol/L阿米洛利组,儿茶素组显著降低(P＜0.01);儿茶素组高于10μmol/L阿米洛利组(P＜0.01),但低于100μmol/L阿米洛利组(P＜0.01)。
结论：⑴儿茶素对脑缺血损伤有很好的保护作用其机制可能与抗凋亡以及有关。⑵mTOR信号通路可能在脑缺血中发挥重要作用,儿茶素,阿米洛利,雷帕霉素的脑保护作用可能与mTOR信号通路相关蛋白有关。⑶ASICs有可能参与mTOR信号通路的调控。