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猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是猪的重要致病菌,引起猪的败血症、关节炎、脑膜炎和心内膜炎等。同时,也是重要的人畜共患病原菌,引起人的脑膜炎、中毒休克综合征及其死亡。根据荚膜多糖抗原性的差异,将其分为33个血清型(1～31、33及1/2),其中1～9型、14型、16型等均能引起猪的疾病,以2型(SS2)致病性最强,流行最广。对于细菌性疾病的防治多以抗生素为主。然而,近些年来,由于抗生素广泛地应用于细菌病的治疗,导致细菌耐药性日趋严重。据指报道,猪链球菌株大多对青霉素和阿莫西林比较敏感,多达85%的菌株对大环内酯类、林可酰胺类、磺胺类药物、四环素类药物有强耐药性。因此,寻找和代替传统抗生素的新型药物用以治疗猪链球菌感染引起了人们的极大关注。抗菌肽,又叫抗微生物肽(Antimicrobial Peptides)或宿主防御肽(Host Defense Peptides)作为广谱抗菌、抗病毒且不易引起耐药的小分子多肽药物受到广泛重视。本研究评价了抗菌肽Nisin(乳酸链球菌素)对不同血清型不同来源的猪链球菌株的体外/体内抑菌效果,以及Nisin与抗生素的联合用药对猪链球菌的抑菌效果,以期为制定猪链球菌病的防控策略提供可以依据。主要研究内容如下:一、Nisin单独或与抗生素联合对的猪链球菌的体外抑菌效果评价通过药敏试验测定了 Nisin对不同血清型及同一血清型的不同菌株的猪链球菌的抑菌效果,大多数细菌对Nisin较为敏感,有少数菌株极为敏感,且最小抑菌浓度范围是0.12207μ/mL～3.90625μg/mL,最小杀菌浓度范围是0.244141μg/mL～7.8125μg/mL;其中GD19(SS2脑膜炎型)的抑菌效果最明显。利用不同浓度的Nisin处理猪链球菌菌株,电镜(TEM和SEM)观察显示,细胞膜萎缩,链状结构断裂,细胞膜破裂且有孔隙出现,内容物明显溢出等,时间杀菌曲线结果显示Nisin对猪链球菌具有快速杀灭作用,即在120min内没有存活细菌。通过药敏试验测定了多种不同种类的抗生素对不同血清型及同一血清型的不同菌株的猪链球菌的抑菌效果,结果显示不同菌株对抗生素的敏感性存在较大的差异,大多数菌株对阿莫西林(93.3 0%0)、头孢噻肟钠(86.7%)最为敏感,青霉素、盐酸四环素次之,对红霉素、左氧氟沙星、阿奇霉素等不敏感。在此基础上检测Nisin与抗生素的联合抑菌效果,结果显示,仅有Nisin+Erythromycin组合的无关作用和拮抗作用超过 90%,Nisin+Levofloxacin Tablets 组合、Nisin+Cefotaxime Sodium 组合、Nisin+Azithromycin组合、Nisin+PenicillinG组合、Nisin+Amoxicillin组合协同与相加作用均在50%以上,且无拮抗作用存在。所以在Nisin与抗生素105个联合组合中,只有3组表现有拮抗作用,说明抗生素与Nisin联合具有协同抑菌效果。二、Nisin单独或与抗生素联合对猪链球菌的体内抑菌效果评价根据前面的试验结果,选取抗生素头孢噻肟钠与Nisin联合,SS代表菌株SS2-1、GD19、GZ0565,利用BALB/c小鼠模型,进行体内联合抑菌效果评价。选用不同浓度Nisin治疗感染了猪链球菌的BALB/c小鼠,确定最适的Nisin浓度。通过测定Nisin对猪链球菌感染的BALB/c小鼠的预防/治疗效果,确定用药的最适方式;选用不同浓度的头孢噻肟钠治疗感染猪链球菌的BALB/c小鼠,确定最适的抗生素的浓度;在此基础上,采用棋盘法,将不同浓度的头孢噻肟钠和Nisin两两混合,检测Nisin是否可降低抗生素的用量或者增加相同剂量抗生素的临床效果。结果:Nisin单独作用于感染猪链球菌的BALB/c小鼠模型,其最适浓度为5mg/kg;Nisin对不同血清型猪链球菌感染的BALB/c小鼠均有一定的治疗和预防效果,SS2型的存活率近80%,且治疗效果高于预防效果,而SS9感染小鼠的存活率约为60%,则预防效果高于治疗效果。且Nisin对SS2感染小鼠的保护效果强于SS9。头孢噻肟钠单独作用猪链球菌感染的BALB/c小鼠,其最适浓度为10mg/kg;Nisin与头孢噻肟將钠的联合体内试验结果显示两者具有协同效果,且抗菌肽和抗生素的用量分别降低了到原来的1/8,显示Nisin与抗生素联合可以减少抗生素的用量。三、Nisin对猪链球菌生物被膜形成的影响选择不同血清型的猪链球菌15株,通过结晶紫染色法筛选可以生成生物被膜的菌株,结果表明 15 株SS菌株中SS2-1、GD19、H6、X5、M51、SH040917、GZ0565等形成生物被膜的能力较强,P1-7、HA0609、H8、2066、X2、DX4-1可以形成生物被膜,但相对上述菌株能力较弱,而100802H30、1728-3则无形成生物被膜的能力。在具有较强形成生物被膜能力的菌株中,选取了 3株菌(SS2-1、GD19和GZ0565),利用不同浓度的Nisin处理生物被膜态的猪链球菌,分别通过结晶紫染色法和电镜两种方法观察Nisin对生物被膜的影响。结晶紫染色法结果显示Nisin处理的SS生物被膜的OD值与未处理对照组相比下降了 5倍左右,差异明显;扫描电镜观察发现.Nisin处理后,聚集团块的SS生物被膜结构稀疏、散在分布,其中单个散在存在的SS有Nisin破坏后残留的痕迹,上述结果表明Nisin可降低猪链球菌生物被膜的形成。综上所述,Nisin对猪链球菌具有较好的抑菌/杀菌效果,且与抗生素具有协同作用;Nisin在体内/体外均能够有效抑制猪链球菌的感染;对不同状态下的猪链球菌(包括生物被膜状态)均具有较好的抑制效果。