前言皮肤的衰老分为内源性老化(endogenous aging)和外源性老化(extraneous aging)。内源性老化又叫自然老化,是自然的衰老过程：外源性老化主要由外界环境因素引起,皮肤作为被覆于机体表面的最大器官,它直接受到紫外线的辐射,因而紫外线(ultraviolet UV)辐射是外源性老化的主要因素,自然界中的UV主要来源于太阳光辐射,所以外源性老化又称为光老化。UV是波长为200-400nm的电磁波,根据其波长不同又分为波长为320-400nm的长波紫外线(UVA)、波长为280-320nm中波紫外线(UVB)和波长为200-280nm的短波紫外线(UVC)。在剂量相同的情况下,UVC对皮肤的损害性最强,其次是UVB,研究表明相同剂量的UVB对皮肤的损伤强度比UVA强约800-1000倍。在三个波段的紫外线中,UVA的穿透性最强,能穿透真皮层,其次是UVB,它仅能照射至表皮层几毫米,UVC穿透性最弱,在穿过大气层时几乎全被臭氧层吸收,自然情况下基本达不到地面。从量上来看,天然的紫外线中UVA的量最大,约占91-99%,UVB仅占少量。因此综合看来光损伤主要由UVA和UVB引起,而UVB是最主要的因素。许多研究表明紫外线对皮肤的损伤与其产生的活性氧簇(reactive oxygen speecies, ROS)造成的氧化应激(oxidative stress)有关。正常情况下,ROS能被皮肤细胞内的抗氧化系统(包括抗氧化酶和抗氧化剂等)转化、消除掉,当紫外线的照射过量时,皮肤内产生较多的ROS,体内的氧化与抗氧化系统的平衡遭到破坏,这些ROS则可引起皮肤组织内脂质、DNA、蛋白质等成分的损伤,破坏皮肤细胞的结构及各种生物代谢功能,从而引起光老化,诱发皮肤癌等。近半个世纪以来由于臭氧层被破坏,紫外线照射到地面上的强度增大,光损害性皮肤病逐渐增多。因此开发具有高活性成分的防晒产品抵抗紫外线的辐射,预防和延缓皮肤衰老已成为目前医学研究的热点。近年来报道了许多抗氧化剂,如抗坏血酸、黄芪甲甙、石榴素、维生素E和p-胡萝卜素等,它们在动物实验及细胞实验中均显示有很好的抗紫外线损伤作用。因此抗氧化剂的应用己成为人们减轻紫外线照射所致皮肤病的有效选择。芦丁(Rutin)又名芸香苷,是一种来源广泛的黄酮类化合物。它主要存在于植物中,具有抗菌消炎、降低毛细血管壁脆性及渗透性、止血、抗氧化和对紫外线具有较强的吸收作用等。目前临床上主要应用于血管性疾病等的治疗。因为芦丁是天然、安全的抗氧化剂,可以考虑用作防晒剂。第一部分芦丁对中波紫外线照射所致HaCaT细胞光损伤的防护作用及其机制目的1.观察不同浓度的芦丁溶液对HaCaT细胞增殖活力的影响2.建立UVB照射HaCaT细胞的光损伤模型3.观察不同浓度的芦丁溶液对UVB照射后HaCaT细胞增殖活力的影响4观察不同浓度的芦丁溶液对UVB照射后HaCaT细胞凋亡率的影响5.观察不同浓度的芦丁溶液对UVB照射后HaCaT细胞分泌TNF-α、IL-6水平的影响方法1.观察不同浓度的芦丁溶液对HaCaT细胞增殖活力的影响1.1 HaCaT细胞的培养用含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的DMEM完全培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下将HaCaT细胞培养于细胞培养箱中。1.2 HaCaT细胞的分组Ⅰ组为正常对照组,不照射UVB,不加入芦丁溶液Ⅱ组为照射对照组,不加芦丁溶液Ⅲ组为基质(DMSO)对照组,培养基含基质DMSO,不含芦丁Ⅳ组为含12.5umol/l芦丁培养基的实验组Ⅴ组为含25.0umol/l芦丁培养基的实验组Ⅵ组为含50.0umol/l芦丁培养基的实验组Ⅶ组为含100.0 umol/l芦丁培养基的实验组1.3 MTT法检测不同浓度的芦丁溶液对HaCaT细胞增殖活力的影响去除细胞培养基,用PBS冲洗1次后,每孔加入5mg/ml的MTT 20μl,继续培养4h,弃上清液,加DMSO 200μl溶解,室温震荡摇匀15分钟,用酶标仪在490nm波长处检测各孔的吸光度A值。2.HaCaT细胞UVB照射后光损伤模型的建立2.1紫外线光源的参数UVB灯管,波长范围290-320nm,峰值312nm,9W,8支,辐照距离为15cm,该处UVB辐射强度为0.75mW/cm2。辐射时间(s)=辐射剂量(mJ/cm2)/辐射强度(mW/cm2)2.2 UVB照射HaCaT细胞观察HaCaT细胞在96孔培养板上生长到每孔融合至80-90%时,将其从培养箱中取出。除Ⅰ组(正常对照组)外,Ⅱ-Ⅷ组均照射UVB,照射剂量为30mJ/cm2,细胞距光源的垂直距离为15cm。3.MTT法检测UVB照射后HaCaT细胞的增殖活力UVB照射后更换新的培养基后置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱继续培养,3板分别培养12h、24 h、48 h后收集细胞,然后每孔加入5mg/ml的MTT20μl,在培养箱培养4h,弃上清液,再加入DMS0200μl摇匀15分钟,用酶标仪测490nm波长处的吸光度A值。4. Annex in V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测不同浓度的芦丁溶液对UVB照射后HaCaT细胞凋亡率的影响.UVB照射方法同2.2,照射后更换新的培养基,继续在培养箱培养24h,收集细胞并经消化、离心,用预冷的PBS清洗两次,滤网过滤,去除未完全消化细胞团块,调整细胞浓度为1×106个/ml。加入Annexin V-FITC 5μl和PI 2.5μ1于流式管中,用流式细胞仪分析检测。5. ELISA法检测不同浓度的芦丁溶液对UVB照射后HaCaT细胞分泌IL-6和TNF—α的影响。UVB照射后后更换新的培养基,继续在培养箱培养24h,收集细胞培养液,离心取上清,使用ELISA试剂盒,严格按照操作说明书检测TNF-α、IL-6的分泌量。结果1.不同浓度的芦丁溶液对HaCaT细胞增殖活力的影响Ⅲ-Ⅶ组与Ⅰ组比较吸光度A值相仿,差异无统计学意义(P>0.05)。本实验结果表明,在12.5-100.0μmol/l浓度范围的芦丁溶液对HaCaT细胞增殖活力无显著性影响,DMSO基质对HaCaT细胞增殖活力亦无显著性影响。2.MTT法检测不同浓度的芦丁溶液对UVB照射后HaCaT细胞增殖活力的影响UVB照射后的各组HaCaT细胞的增殖活力均显著降低(P<0.01)。浓度在25-100μmol/l的芦丁可以显著提高UVB照射后HaCaT细胞的增殖活力(P< 0.01),12.5μmol/l的芦丁组及基质组对UVB照射后HaCaT细胞增殖活力无显著性影响(P>0.05)。UVB照射后Ⅱ’Ⅷ组同一组MTT12、MTT24、MTT18相比较,HaCaT细胞的增殖活力随着时间的延长而降低,其差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组MTT12、MTT24、MTT48两两比较,HaCaT细胞的增殖活力无明显改变,其差异无统计学意义(P>0.05)。3.不同浓度的芦丁溶液对UVB照射后HaCaT细胞凋亡率的影响UVB照射后的各组HaCaT细胞的凋亡率均显著升高(P<0.01)；浓度在12.5～100 umol/l的芦丁可以显著降低UVB照射后HaCaT细胞的凋亡率(P<0.05)；基质组对UVB照射后HaCaT细胞的凋亡率无显著性影响(P>0.05)。Ⅳ-Ⅶ组的HaCaT细胞凋亡率与芦丁药物浓度成负相关(r=-1,P<0.01)。4.ELISA法检测不同浓度的芦丁溶液对UVB照射后HaCaT细胞分泌IL—6和TNF—α的影响。UVB照射后的各组HaCaT细胞分泌IL一6和TNF—α的量均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01)；Ⅳ-Ⅶ组HaCaT细胞IL—6、TNF—α的分泌量随着芦丁药物浓度的增加而降低,且HaCaT细胞IL—6、TNF—α的分泌量与芦丁药物浓度成负相关(r=-l,P<0.01)。结论本实验表明：芦丁在一定浓度范围内对UVB照射损伤的HaCaT细胞有一定的防护作用,该作用随芦丁浓度的升高而升高,这可能与芦丁可以提高UVB照射后HaCaT细胞增殖活力、降低HaCaT细胞的凋亡率、抑制细胞因子IL—6和TNF—α的分泌量有关。第二部分芦丁制剂对紫外线所致昆明小鼠皮肤光损伤的防护作用其机制目的1.建立光老化昆明小鼠模型2.观察昆明小鼠外用芦丁制剂后UVA+UVB照射对皮肤外观状态的影响3.观察昆明小鼠外用芦丁制剂后UVA+UVB照射对皮肤组织形态学的影响4.观察昆明小鼠外用芦丁制剂后UVA+UVB照射对皮肤丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响5.观察昆明小鼠外用芦丁制剂后UVA+UVB照射对皮肤MMP-1 mRNA水平的影响方法1.光老化昆明小鼠模型的建立1.1实验动物及动物分组清洁级白色昆明小鼠60只,雌雄各半,体重20-25 g,鼠龄6-8周,购自山东中医药大学医学实验动物中心,在普通级动物饲养房内饲养,每笼6只,同性别饲养。实验开始后,将昆明小鼠随机分成5组：每组12只,雌雄各半：A组：基质对照组(不照射紫外线)B组：芦丁对照组(不照射紫外线)C组:UVA+UVB照射组D组:UVA+UVB照射+基质组E组:UVA+UVB照射+芦丁组1.2紫外线照射前准备SS-04型台式紫外线光疗仪,安装有UVA灯管9支,每支15W,波长范围320-400nm,照射高度为15cm。另有UVB灯管4支,40W,波长范围290-320nm,将4支灯管制成灯箱,照射高度为50cm。1.3造模及给药方法用婴儿理发器剃除小鼠背部的绒毛,照射前1小时外涂受试样品。除A、B组外,其余三组前3周均隔日照射UVA+UVB1次,每次先在距光源50cm处先进行UVB照射,每次剂量为50mJ/cm2,然后进行UVA照射,光源高度为15cm,每次剂量为10J/cm2。第4周起每日照射1次,连续UVB+UVA照射共14周,113次,UVB总剂量为5.65J/cm2,UVA,总剂量为1330J/cm2。2.昆明小鼠照射紫外线后肤外观状态变化的检测在照射过程中,每周观察实验组、对照组昆明小鼠背部皮肤,试验结束后根据评分标准进行评分。3.昆明小鼠皮肤组织形态学改变及真皮内胶原纤维和弹力纤维改变的检测末次UVA+UVB照射实验结束后,处死小鼠,取背部照射区部分皮肤组织,制片后分别进行HE染色、Van Gieson (VG)染色、Weigert染色,在显微镜下观察小鼠皮肤组织形态学的改变及真皮内胶原纤维和弹力纤维的变化。4.昆明小鼠皮肤丙二醛(MDA)含量及抗氧化酶活性的测定4.1组织匀浆的制备末次UVA+UVB照射实验结束后,处死小鼠,取昆明小鼠背部照射区部分皮肤,去除皮下脂肪称重,制成10%组织匀浆,以3000转／分钟的速度离心10分钟,取上清液进行各指标测定。4.2昆明小鼠皮肤MDA含量的测定严格按MDA试剂盒说明书操作上样,充分混匀,95℃水浴放置40分钟,取出后流水冷却,然后以3500转／分钟的速度离心10分钟,取上清液,分光光度计于532nm处比色,测各管的吸光度A值。4.3超氧化物歧化酶(SOD)活性的检测严格按SOD试剂盒说明书操作,分光光度计于波长550nm处比色,测各管吸光度A值。4.4谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性检测严格按GSH-Px试剂盒说明书操作,分光光度计于波长412nm处比色,测各管吸光度A值。5.荧光实时定量PCR (Real-Time Quantitative-PCR)检测紫外线照射后昆明小鼠皮肤中MMP-1mRNA水平。末次UVA+UVB照射实验结束后,处死小鼠,取昆明小鼠背部照射区部分皮肤,冷冻匀浆,应用试剂提取总RNA,分光光度计测定RNA浓度和纯度,逆转录反应得到cDNA,通过Real-Time q-PCR技术测定MMP-1 mRNA水平。结果1.昆明小鼠皮肤外观状态的变化未经紫外线照射的A组与B组相比较,昆明小鼠的皮肤外观评分无明显改变(P>0.05)。照射组(C、D、E组)与未照射组(A、B组)相比较,昆明小鼠的皮肤外观评分均明显增高(P<0.01)；C组(照射组)与D组(照射+基质组)比较,昆明小鼠的皮肤外观评分无明显改变(P>0.05)；C、D组与E组(照射+芦丁组)比较,昆明小鼠的皮肤外观评分明显增高(P<0.01)。2.昆明小鼠皮肤组织形态学改变及真皮内胶原纤维和弹力纤维改变的检测A和B组：小鼠皮肤表皮层结构完整,较薄,细胞分层清晰,具有明显的表皮乳突及真皮乳头；真皮层可见波浪状胶原纤维组织,胶原纤维的粗细及分布皆均匀,没有明显断裂及排列紊乱现象；真皮浅层弹力纤维与表皮平行排列,粗细均匀。C和D组：表皮厚度不一,角化过度,表皮层常有部分脱落,乳头层变平,真皮层变厚明显；真皮内胶原纤维增粗、常有断裂现象,且排列紊乱；弹力纤维增多、变粗,部分增生的弹力纤维断裂、缠结；炎性细胞浸润多见,皮脂腺不规则增生E组：其组织学改变位于A、B组及C、D组之间。3.昆明小鼠皮肤MDA含量的测定C、D、E组昆明小鼠UVA+UVB照射后皮肤MDA含量均显著升高,与未经照射的A、B组比较差异均有统计学意义(P<0.01),其中C、D组昆明小鼠UVA+UVB照射后皮肤MDA含量升高最明显,两组比较差异无统计学意义(P>0.05),E组MDA含量升高低于C、D组,差异有统计学意义(P<0.01),A和B组MDA含量相仿,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.昆明小鼠皮肤抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性的检测C、D组昆明小鼠UVA+UVB照射后皮肤抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性均显著降低,与A和B组比较差异有统计学意义(P<0.01),A、B组抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性均相仿,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。C、D组昆明小鼠抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性均相仿,两组比较差异无统计学意义(P>0.05),E组抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性均高于C、D组,差异有统计学意义(P<0.01)。5.实时荧光定量PCR (Real-Time Quantitative-PCR)检测紫外线照射后昆明小鼠皮肤中MMP-1 mRNA水平。C、D、E组昆明小鼠UVA+UVB照射后皮肤MMP-1 mRNA水平均显著升高,与未被照射的A、B组比较差异有统计学意义(P<0.01),其中C、D组昆明小鼠照射后皮肤MMP-1 mRNA水平升高最明显,两组比较差异无统计学意义(P>0.05), E组MMP-1 mRNA水平低于C、D组,差异有统计学意义(P<0.01),A和B组MMP-1 mRNA水平相仿,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论本实验结果表明,长期UVA+UVB照射可致昆明小鼠皮肤出现光老化改变,外用0.5%芦丁乳膏对紫外线有一定防护作用,其机制可能是芦丁有较强的抗氧化活性,可以在一定程度上抑制UVA+UVB照射所致的脂质过氧化反应,从而减轻昆明小鼠皮肤MDA含量的升高,增强抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性,并抑制MMP-1 mRNA水平的升高。