【摘 要】
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抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)在高等植物的抗逆、抗病等过程中具有重要作用。植物细胞内的AsA在线粒体中合成,其最后一步合成反应(L-半乳糖酸内酯→AsA)由L-半乳糖酸内酯脱氢
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抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)在高等植物的抗逆、抗病等过程中具有重要作用。植物细胞内的AsA在线粒体中合成,其最后一步合成反应(L-半乳糖酸内酯→AsA)由L-半乳糖酸内酯脱氢酶(GLDH)催化。植物细胞内的AsA合成受线粒体呼吸链调控,但详细的调控机理仍不清楚。本论文针对线粒体呼吸链对植物抗坏血酸生物合成的调控作用开展一些研究。 首先利用RT-PCR技术成功地克隆了烟草GLDH编码基因的部分序列(805bp),并进一步将该序列克隆到pET-42a原核表达质粒中,限制性酶切分析及测序结果表明已成功地构建了重组表达质粒,插入方向正确且阅读框架无移码突变。将该重组表达质粒转化大肠杆菌,经SDS-PAGE分析,发现在约66kD处有特异性表达产物,表明所克隆的GLDH编码基因的部分序列在大肠杆菌中以融合蛋白形式获得表达。经摸索,该融合蛋白在27℃下经0.75mM IPTG诱导3hr后表达量较多。上述结果为制备GLDH的抗体,以研究呼吸链对植物GLDH基因表达的调控作用奠定了一些基础。 此外,建立了HPLC法测定AsA的体系,初步探索了GLDH和呼吸复合物Ⅰ对烟草悬浮细胞AsA合成的贡献、高温胁迫对其AsA生物合成的影响,证实高温条件下烟草悬浮细胞中GLDH对AsA生物合成的贡献下降,而呼吸复合物Ⅰ的贡献上升。
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