临床实践中发现,慢加急性肝衰竭是在慢性肝病基础上由于急性损伤因素的刺激而引起的肝功能衰竭,和急性肝衰竭相比肝脏组织学损伤相对较轻,血清学指标也相对较好,因此能够用于治疗干预的时间相对较长。这一有趣的临床现象提示基础肝纤维化/肝硬化患者对急性损伤的耐受性和无基础肝病的患者相比更强。然而其机制却并不明确。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1,HMGB1)是一种损伤相关的分子模式,能从细胞核移位至细胞浆,HMGB1的功能和其分布位置密切相关。细胞外HMGB1的来源主要是免疫细胞和坏死的细胞。枯否细胞(kupffer cells,KCs)可于不同的代谢和免疫微环境下活化为多种表型,其代表性活化形式为:经典活化的KCs(M1型)和替代活化的KCs(M2型)。M1型和M2型活化状态的KCs有不同的特点和功能。最近的研究表明,HMGB1与肝纤维化的发生有关,肝纤维化基础上的损伤保护作用又有KCs的参与。目前尚未见有关KCs的活化状态、HMGB1的表达和肝纤维化基础上的损伤保护作用的报道。本研究首先比较了正常小鼠、四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化6w的小鼠、以及肝纤维化自发逆转不同时间点的小鼠给予致死剂量的D-氨基半乳糖/脂多糖(D-galactosamine/lipopolysaccharide,D-Gal N/LPS)刺激后肝脏对损伤的耐受性。然后观察了上述小鼠给予急性损伤后肝细胞中HMGB1的核外移位、细胞外释放以及HMGB1所介导的炎症反应的变化。第三部分比较了正常和肝纤维化6w的小鼠肝脏中KCs活化类型的差异,以及体外分别给予LPS或HMGB1肽刺激后KCs中HMGB1的核外移位发生情况。最后观察了HMGB1对D-Gal N/TNF-α诱导的小鼠肝细胞系AML-12细胞凋亡的影响,并探索其可能的信号通路。本实验研究内容共分四部分:第一部分四氯化碳诱导的肝纤维化能够保护小鼠抵抗D-氨基半乳糖/脂多糖诱导的肝损伤目的动态观察CCl4诱导的肝纤维化以及肝纤维化自发逆转不同时间点的小鼠对致死剂量的D-Gal N/LPS诱导的急性肝损伤的耐受性。方法1.CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型的建立:给予Balb/c和C57BL/6J小鼠腹腔注射CCl4诱导肝纤维化模型,每周2次,共6w。Masson染色和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫荧光染色检验肝纤维化模型是否诱导成功。2.急性损伤:分别给正常小鼠和肝纤维化6w的小鼠腹腔注射D-Gal N(1mg/g)/LPS(50 ng/g)建立急性损伤的小鼠模型,分4组:正常对照组(cont)、正常对照+急性损伤组(cont+D-Gal N/LPS)、肝纤维化6w组(Fib)、肝纤维化6w+急性损伤组(Fib+D-Gal N/LPS),每组4-6只小鼠。血清及肝组织样本均在急性损伤后24h收集。3.观察急性损伤前后4组小鼠血清谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)的水平以及肝组织病理学的改变,比较正常对照组和肝纤维化6w组小鼠对致死剂量的D-Gal N/LPS诱导的急性肝损伤的耐受性。4.动态观察肝纤维化自发逆转(Spontaneous regression)不同时间点的小鼠对急性肝损伤的耐受性:小鼠纤维化模型诱导成功后,停止腹腔注射CCl4,并分别于最后一次注射CCl4的第3天(R3d),第9天(R9d),第15天(R15d)给予腹腔注射D-Gal N(1 mg/g)/LPS(50 ng/g)造成急性肝损伤。血清及肝组织样本均在损伤后24h收集。采用Masson染色和Ⅰ型胶原蛋白免疫荧光染色观察肝纤维化的自发逆转情况动态观察并比较以上各组小鼠急性肝损伤前后血清中ALT的水平及肝组织病理学的改变。结果1.Masson染色和α-SMA免疫荧光染色提示肝纤维化小鼠模型诱导成功。肝纤维化自发逆转不同时间点的小鼠,按照R3d、R9d至R15d的顺序,Masson染色和Ⅰ型胶原蛋白免疫荧光染色显示胶原纤维逐渐减少,肝脏结构逐渐恢复正常。2.正常对照组小鼠经腹腔注射D-Gal N/LPS后,血清ALT、AST水平均明显升高,而肝纤维化6w组小鼠血清ALT、AST水平升高却并不明显,且正常对照组小鼠给予急性损伤后血清转氨酶水平明显高于给予同样损伤的肝纤维化6w组小鼠(cont vs cont+D-Gal N/LPS,cont+D-Gal N/LPSvs Fib+D-Gal N/LPS,P<0.01)(Fibo vs Fib+D-Gal N/LPS,P>0.05)。肝组织病理学显示:正常对照组及肝纤维化6w组小鼠给予D-Gal N/LPS损伤后均出现一定程度的肝细胞变性、坏死及炎细胞浸润。然而,肝纤维化6w组小鼠给予急性损伤后肝细胞变性、坏死程度和给予同样打击的正常对照组小鼠比较明显减轻,浸润的炎细胞也明显减少,差异有统计学意义(cont+D-Gal N/LPS vs Fib+D-Gal N/LPS,P<0.05)。3.分别给予肝纤维化自发逆转不同时间点的小鼠注射D-Gal N/LPS后,发现按照R3d,R9d至R15d的顺序,血清ALT水平逐渐升高,肝细胞坏死程度逐渐加重,浸润的炎细胞也增多,提示肝脏损伤程度逐渐加重。因此,随着肝纤维化自发逆转的向前推进,肝纤维化基础上的损伤保护作用逐渐减弱至消失。第二部分肝纤维化小鼠给予D-氨基半乳糖/脂多糖损伤后肝细胞内HMGB1的核外移位和细胞外释放被抑制目的分析HMGB1在肝细胞内的分布位置和肝纤维化损伤保护作用的相关性,初步探索肝纤维化损伤保护作用的分子机制。方法1.ELISA方法比较正常对照组、肝纤维化6w组以及肝纤维化自发逆转不同时间点R3d,R9d,R15d的小鼠给予致死剂量的D-Gal N/LPS攻击后血清内HMGB1的水平。2.免疫组织化学方法观察正常对照组、肝纤维化6w组以及肝纤维化自发逆转不同时间点R3d,R9d,R15d的小鼠给予致死剂量的D-Gal N/LPS损伤后肝细胞内HMGB1的表达和核外移位现象。3.RT-PCR方法比较正常对照组、肝纤维化6w组以及肝纤维化自发逆转不同时间点R3d,R9d,R15d的小鼠给予致死剂量的D-Gal N/LPS损伤后肝组织内HMGB1介导的炎症因子IL-12,IL-6,TNF-α基因m RNA的表达水平,并同时检测了肝组织中NF-κB(HMGB1和受体结合后能激活NF-κB,激活的NF-κB又能促进以上炎症因子的释放)和HMGB1基因m RNA的表达水平。结果1.正常对照组、R9d、R15d的小鼠分别给予致死剂量的D-Gal N/LPS损伤后,血清内HMGB1的水平和损伤前相比明显升高,差异有统计学意义(均p<0.05)。而肝纤维化6w组和R3d的小鼠给予同等剂量的D-Gal N/LPS损伤后,血清内HMGB1的水平和损伤前相比变化却并不明显,差异无统计学意义(均p>0.05)。2.正常对照组、R9d、R15d的小鼠分别给予D-Gal N/LPS攻击后,肝细胞中HMGB1发生了明显的核外移位和细胞外释放。而肝纤维化6w组及R3d的小鼠给予同样刺激后,并未发生这种现象,多数肝细胞内HMGB1仍然分布于细胞核,只有少数几个肝细胞中发生了HMGB1的核外移位。3.正常对照组、R9d、R15d的小鼠分别给予D-Gal N/LPS损伤后,肝组织内IL-12,IL-6,TNF-α,NF-κB和HMGB1基因m RNA的表达水平和损伤前相比明显升高,差异有统计学意义(均p<0.05)。而肝纤维化6w组及R3d的小鼠给予同样刺激后,肝组织内IL-12,IL-6,TNF-α,NF-κB和HMGB1基因m RNA的表达水平和损伤前相比变化不大(均p>0.05)。第三部分纤维化肝脏中M2型枯否细胞给予LPS或HMGB1肽刺激后HMGB1的核外移位被抑制目的研究纤维化肝脏中KCs的活化类型以及其活化类型对HMGB1核外移位的影响,初步探索KCs的活化类型以及HMGB1在细胞内的分布位置和肝纤维化损伤保护作用的相关性。方法1.从正常对照组小鼠,正常小鼠给予注射D-Gal N/LPS造成的急性损伤组以及肝纤维化6w组小鼠的肝脏中分离并体外培养KCs。2.采用RT-PCR方法鉴定以上3组小鼠肝脏中分离出来的KCs的活化类型。3.从正常对照组,肝纤维化6w组小鼠肝脏中分离出的KCs均给予LPS或HMGB1肽作用,20h后采用免疫荧光染色方法观察以上2种KCs中HMGB1的核外移位情况。结果1.从肝纤维化6w组小鼠肝脏中分离出来的KCs主要以M2型为主。从正常小鼠注射D-Gal N/LPS造成的急性损伤组中分离出来的KCs主要以M1型为主。2.正常对照组小鼠分离出来的KCs中,LPS或HMGB1肽能促进HMGB1的核外移位。从肝纤维化6w小鼠肝脏中分离出来的KCs中,HMGB1多位于细胞核内,既使给予LPS或HMGB1肽刺激,仍未发现HMGB1的核外移位。第四部分HMGB1通过TLR4途径促进D-Gal N/TNF-α诱导的小鼠肝细胞的凋亡目的观察HMGB1在D-Gal N/TNF-α诱导的小鼠肝细胞系AML-12细胞凋亡过程中的作用,并探索其可能的信号通路。方法1.给予HMGB1肽预处理小鼠AML-12细胞,然后采用TNF-α/D-Gal N诱导AML-12细胞凋亡,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测HMGB1肽对AML-12细胞凋亡率的影响。2.给予TLR4抗体预处理小鼠AML-12细胞,然后采用TNF-α/D-Gal N诱导AML-12细胞凋亡,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测TLR4抗体对AML-12细胞凋亡率的影响。采用RT-PCR方法测定诱导凋亡后小鼠肝细胞中Bax、Bcl-2、NF-κB、TLR4、HMGB1基因m RNA的水平。采用western blot方法测定诱导凋亡后小鼠肝细胞中Bax、Bcl-2、NF-κB、TLR4、HMGB1蛋白的水平。结果1.HMGB1肽能促进TNF-α/D-Gal N诱导的AML-12细胞的凋亡。HMGB1肽预处理细胞并诱导凋亡后,细胞凋亡率升高。2.TLR4抗体能够增加AML-12细胞对TNF-α/D-Gal N诱导的凋亡的耐受性。TLR4抗体预处理细胞并诱导凋亡后,细胞凋亡率下降,细胞中Bax、NF-κB、TLR4基因m RNA水平下调,Bcl-2、HMGB1基因m RNA水平上调。蛋白的表达水平和基因m RNA的变化一致。结论1.CCl4诱导的肝纤维化能够保护小鼠抵抗致死剂量的D-Gal N/LPS诱导的肝损伤,随着肝纤维化自发逆转的推进,该损伤保护作用逐渐消失。2.肝纤维化小鼠给予D-Gal N/LPS诱导损伤后,肝细胞内HMGB1的核外移位和细胞外释放被抑制,并且伴随肝组织内HMGB1诱导的炎症反应的减弱。随着肝纤维化自发逆转的推进,给予相同刺激后,肝细胞内HMGB1的核外移位和细胞外释放现象又逐渐出现。3.肝纤维化小鼠肝脏中分离出来的KCs主要以M2型为主,M2型KCs中LPS或HMGB1肽诱发的HMGB1的核外移位被抑制。4.HMGB1可能通过TLR4途径促进TNF-α/D-Gal N诱导的AML-12细胞的凋亡。