背景：　　近年来，由于难治性急性白血病和实体瘤患者化疗后出现前所未有的反应，癌症的免疫疗法成为了热点问题。肿瘤免疫疗法是目前治疗恶性肿瘤的有效方法之一，其中嵌合抗原受体的 T细胞治疗技术是这几年来发展较为迅速的肿瘤免疫疗法之一[1-2]。CART细胞治疗技术在B细胞恶性肿瘤的临床应用取得了显著的效果。最近针对CD19的CAR T细胞已经从实验室跳到临床，结果显著。在多达90％的复发或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者中，CD19靶向的 CAR T 细胞已经诱导了疾病的完全缓解，而化疗的预期完全缓解率为30％。这些疗法最近取得的成功是CAR载体设计改进迭代过程的完成。　　目的:　　构建最优的基于2A多肽策略的抗CD19嵌合抗原受体表达载体，为后期的临床治疗研究提供基础。　　方法：　　通过分子克隆技术构建pGIZ-EF1α-19CAR和4-1BBL表达载体，然后连接到 pGIZ-EF1α-19CAR-P2A-4-1BBL 表达载体中。将构建的重组质粒与两种包装质粒（psPAX.2和PMD2.G）共转染293T细胞以制备所需的慢病毒;MACS珠粒分选技术在分选健康人外周血T细胞时，利用antiCD2-antiCD3-antiCD28单克隆抗体磁珠加 IL-2 体外扩增培养 T 细胞; 浓缩后的慢病毒感染 T 细胞，建立CAR-T细胞，利用流式细胞术检测19CAR和4-1BBL的共表达; 通过细胞杀伤实验等手段检测CAR-T特异性杀伤细胞的功能。　　结果：　　1、通过琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定构建的 pGIPZ-19CAR-IRES-4-1BBL 慢病毒表达载体和pGIPZ-19CAR-P2A-4-1BBL慢病毒表达载体,构建成功。　　2、流式细胞术检测 19CAR 和 4-1BBL 的共表达，分别包装获得19CAR-P2A-4-1BBL 和 19CAR-IRES-4-1BBL 慢病毒转染 293T 细胞，制得CAR-T 细胞，并利用流式细胞仪检测阳性细胞百分率，测定 CAR 的表达，流式结果表明CD19-CAR-构建成功，可以在细胞膜表面表达。　　3、19CAR-IRES-4-1BBL和19CAR-P2A-4-1BBL感染T细胞后扩增能力比较。分别包装获得19CAR-P2A-4-1BBL和19CAR-IRES-4-1BBL慢病毒，感染正常人T细胞后记录两者体外扩增的数量变化, 两者之间无统计学差异（P>0.05）　　4、制备的病毒溶液感染 T 细胞。通过 19CAR-IRES-4-1BBL 和19CAR-P2A-4-1BBL 感染 T 细胞后杀伤能力比较。两者均随效靶比的递增，细胞杀伤力变大，当CAR-T细胞与靶细胞比例达到40:1时，细胞裂解率达到90%左右。两者CAR-T细胞的细胞杀伤能力无统计学差异（P>0.05）。　　结论：　　本课题成功构建了基于2A肽策略的慢病毒表达载体，通过转染获得所需病毒颗粒，慢病毒颗粒感染磁珠分选的 T细胞获得抗CD19 CAR-T细胞，初步构建了治疗 B细胞恶性肿瘤的CAR-T技术平台。