急性呼吸道感染是一种危害公共健康的常见疾病,为应对急性呼吸道感染对经济社会造成的影响,了解其临床特征与致病规律,中国建立了住院严重急性呼吸道感染病例哨点监测网,开展急性呼吸道感染病原监测与研究工作。识别病原是急性呼吸道感染监测和防控的首要环节,然而由于引起急性呼吸道感染的病原种类多样,易出现变异,存在多种病原共感染,以及各种新发传染病病原体的不断出现,为急性呼吸道感染的病原识别带来巨大困难。目前,临床常用的病原体检测方法主要有分离培养、免疫学检测、分子生物学检测等。病原体的分离培养与鉴定是临床感染性疾病病原体诊断的“金标准”,但这一方法耗时长,检出率低。胶体金等免疫学检测方法和PCR等分子生物学检测方法仅能检测已知的有限种类的病原,无法实现对罕见或新发病原的检测。宏基因组测序的方法可以无需对临床样本进行病原体分离培养,直接对样本中所有微生物核酸进行检测,不仅可以同时检测样本中存在的多种微生物,也可对一些常规方法难以识别的可能与感染相关的微生物进行检测,正成为一种感染病原检测的新方法。传统的呼吸道样本病原宏基因组测序需要分别对样本提取DNA或RNA进行建库,不仅操作繁琐,而且难以实现在同一反应体系内对RNA和DNA病原微生物同时进行检测。基于此,本研究建立一种DNA/RNA病原宏基因组共测序的方法,即对临床样本提取的总核酸在不去除DNA的情况下,直接进行随机引物反转录与c DNA二链合成,对产物进行DNA建库与测序,以实现同时检测样本中多种不同类型微生物序列的目的。通过在健康人咽拭子中加入可引起呼吸道感染的5种不同类型的病原(RNA病毒:甲型流感病毒;DNA病毒:人腺病毒;G~+细菌:金黄色葡萄球菌;G~-细菌:肺炎克雷伯菌;真菌:烟曲霉)建立模拟样本,并对不同病原进行梯度稀释,验证该方法对单病原模拟样本与多病原模拟样本的病原检测能力。结果表明,针对单病原样本,该方法检测到的目标病原序列数,与样本中原始病原浓度及荧光定量PCR检测Ct值之间,均呈现出一定的线性关系;针对多病原样本,该方法在5例不同稀释梯度的多病原样本中均检出了5种目标病原序列,证明了该方法可以实现对样本中多种不同类型病原的同时检测,也为急性呼吸道感染病原监测提供了一种新的方法。二代测序技术具有通量大、准确度高等优势,三代纳米孔测序技术则具有序列读长更长、便携性高、实时测序等优势。为评估基于DNA/RNA共测序法结合不同的测序技术所适用于何种应用场景,本研究选取一例急性呼吸道感染患者的肺泡灌洗液样本,分别开展基于纳米孔三代测序技术和BGI二代测序技术的宏基因组测序,并同时开展样本的病原分离培养,分析三种方案的检测结果是否一致,并比较三种方案的检测周期。纳米孔测序、BGI二代测序及病原分离培养三种方案对该例样本的病原判定结果均为铜绿假单胞菌,三者的检测周期分别约为12小时、154小时、50小时。纳米孔测序方案在测序第55分钟即检测到1条铜绿假单胞菌序列,检测周期在三种方案中最短,有望进一步应用于临床感染的病原实时快速检测。BGI二代测序方案的测序结果中,铜绿假单胞菌在微生物序列中的占比最高(58.94%),同时也检测到了金黄色葡萄球菌、人疱疹病毒7型、痤疮丙酸杆菌等微生物的序列,相较于纳米孔测序方案能够获得样本中更为详细的微生物丰度信息,但其检测周期较长,对于开展大规模的呼吸道病原监测等对检测周期没有特殊需求的场景时更有优势。目前急性呼吸道感染病原监测主要采用荧光定量PCR等方法,宏基因组测序技术尚未大规模开展。同时,目前的监测工作以流感病毒的监测为主,其他病原体的信息相对缺乏。为验证宏基因组测序技术在急性呼吸道感染病原监测中的应用价值,本研究基于DNA/RNA共测序的方法,依托北京市SARI病例监测网,收集了2017年12月至2019年7月期间的SARI死亡病例样本64例与非死亡病例样本21例,通过宏基因组测序识别样本中可能的致病病原。宏基因组测序技术对甲型流感病毒检测的灵敏度为73.33%,特异度为95.92%,一致率为90.63%。对测序结果与监测结果进行Kappa分析,Kappa值为0.726,说明宏基因组测序法对甲型流感病毒检测结果与SARI流感监测结果具有高度的一致性。与此同时,样本中还检测出KI多瘤病毒、甘露醇罗尔斯顿菌、嗜麦芽窄食单胞菌等可能与感染相关的微生物,同时发现部分样本中可能存在细菌-病毒共感染的情况,部分样本中存在丰度>50%的优势物种。宏基因组测序能够发现常规检测方法不易识别的可能与感染相关的微生物,识别样本中可能存在的共感染,获得样本的物种丰度等信息,有望成为传统病原检测方法的重要补充,为北京地区SARI病原的监测、溯源、预警及防控提供技术支撑和科学依据。综上所述,本研究建立了DNA/RNA病原宏基因组共测序方法,可以实现对样本中细菌、病毒等不同类型病原的同时检测。该方法结合纳米孔实时测序平台可以实现临床未知病原感染的快速识别,结合高通量二代测序平台则有望应用于大规模样本的公共卫生病原监测,为急性呼吸道感染病原识别提供了技术支撑和重要参考。