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类猪圆环病毒P1是从临床疑似猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)病猪的血清中分离到的,全长648个核苷酸,是目前发现的基因组最小的动物病毒,部分序列与猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus type 2,PCV2)开放阅读框2(open reading frame2,ORF2)的序列高度同源。前期研究表明,P1病毒可引起转染的PK-15细胞凋亡,也可导致感染猪出现类似PMWS的临床症状。本论文主要内容如下:1.类猪圆环病毒P1 ORF2和ORF3的鉴定P1病毒主要包括3个开放阅读框,为从转录水平和蛋白水平鉴定其ORF2和ORF3,用P1双拷贝分子克隆(pSK-P1)转染PK-15细胞,采用Trizol法提取转染细胞的总RNA,纯化后进行RT-PCR扩增,回收PCR产物并测序。利用cDNA末端快速扩增法(Rapid-amp1ification of cDNAends,RACE)技术分别扩增 ORF2 和 ORF3 的5’-与3’-末端。同时,根据ORF2和ORF3编码的氨基酸序列预测其B细胞抗原表位,采用逐步固相合成法合成多肽,与匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,常规间接ELISA法检测血清效价。通过免疫组化方法检测转染pSK-P1的PK-15细胞与两种多抗的免疫反应性。结果表明:以P1病毒RNA为模板,用ORF2和ORF3特异引物进行的RT-PCR均能扩增出目的基因片段,分别与P1病毒ORF2和ORF3的序列同源性达100%;RACE技术分析,可知P1病毒ORF2的5’-和3’-末端分别在nt648和nt481,ORF3的5’-和3’-末端分别在nt364和nt70。合成肽的氨基酸序列分别为ORF2:CLSRLPQSERPPGRW和ORF3:CVYPKVRERRVLKMP;用ORF2和ORF3表位肽与KLH的偶联物制备的多抗效价均在1:512000以上,免疫组化检测结果显示2种抗体均能够与P1病毒发生特异性显色反应。综上,通过转录分析及免疫组化法分别从转录水平和蛋白水平证实了类猪圆环病毒P1 ORF2和ORF3的存在。2.类猪圆环病毒P1三种主要蛋白在昆虫细胞中的表达分析为鉴定P1病毒3个主要开放阅读框所编码的蛋白能否在体外自组装形成病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs),设计3对引物分别扩增P1病毒的ORF1、ORF2和ORF3,连接到载体pFastBacTM1,构建重组表达质粒,脂质体法转染Sf9细胞获得重组杆状病毒(rBac-ORF1、rBac-ORF2 和 rBac-ORF3)。通过 RT-PCR 及 Western blot分别从转录水平和蛋白水平鉴定表达情况,透射电镜观察是否形成VLPs。结果显示,重组质粒转染Sf9细胞后,均可导致细胞病变;从接毒细胞中提取总RNA,除去基因组DNA后,利用RT-PCR能够扩增出相应目的片段;Western blot结果显示,rBac-ORF1表达产物能够与抗P1VP1单抗和多抗发生特异反应;电镜观察发现,3种重组蛋白均可在Sf9细胞中形成近椭圆形的包涵体。综上,本研究利用杆状病毒表达载体系统成功地在Sf9细胞中表达了 P1病毒ORF1、ORF2和ORF3基因,并证实在本试验条件下这3种重组蛋白均不能自组装成VLPs。本研究为进一步探究P1病毒蛋白的其他功能特性奠定了基础。