一直以来,牙周组织再生(包括软硬组织的再生),是一个具有挑战性的问题。组织工程技术在牙周再生领域的应用成为近年来关注的热点。种子细胞的来源,是组织工程成功与否的关键。已有研究表明牙根表面的牙周膜中有干细胞(periodontal ligament stem cells derived from root surface, r-PDLSCs)的存在,在体内可以生成牙骨质/牙周膜样组织,可以促进牙周组织的再生。牙周膜细胞是一个异质性细胞群,牙周膜干细胞有可能由于存在部位的不同而存在性质上的差异。本实验从牙槽窝表面的牙周膜中分离出牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells derived from alveolar bone surface, a-PDLSCs),对其干细胞生物学特性及牙周再生方面的应用做了一系列分析,通过与牙根表面牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞(BMSCs)作比较,分析了两部分来源牙周膜干细胞性质的差异。为牙周再生中,牙周膜干细胞的应用开辟了思路。主要研究成果如下:第一部分:牙槽窝来源牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性鉴定为了证明拔牙后牙槽窝中牙周膜的存在,模拟正常拔牙程序拔除SD大鼠磨牙,通过H&E染色对拔牙后牙槽窝及牙根面进行组织学观察,结果显示牙拔除术后,牙根表面和牙槽窝表面都粘附有牙周膜组织。通过在SD大鼠体内原位标记BrdU,通过免疫荧光实验检测牙周膜中干细胞对BrdU的长期吸附能力。结果显示干细胞在牙周膜中的分布具有不对称性,靠近牙槽窝侧的牙周膜干细胞要多于牙根表面侧。通过酶消化联合组织块培养法成功的从拔牙后人牙槽窝表面牙周膜中分离出了干细胞。通过克隆形成率分析、MTT分析、流式细胞周期分析对牙槽窝来源牙周膜干细胞的增殖能力进行鉴定,结果显示,牙槽窝来源牙周膜干细胞和牙根表面来源牙周膜干细胞的增殖能力相似,都强于骨髓间充质干细胞。通过流式细胞仪对表面抗原进行检测,发现牙槽窝来源牙周膜干细胞阳性表达间充质干细胞表面标记,阴性表达造血系来源细胞的表面标记。通过免疫荧光技术发现a-PDLSCs阳性表达成骨相关基因COLⅠ和OCN。碱性磷酸酶活性的检测结果显示,a-PDLSCs对碱性磷酸酶的表达要高于r-PDLSCs。通过Real-time PCR技术从RNA水平对成骨及韧带组织相关基因进行定量分析,结果显示,a-PDLSCs对于矿化相关基因的表达都高于r-PDLSCs;对于韧带组织相关基因Scleraxis的表达,牙周膜干细胞要低于BMSCs。以上结果证明牙槽骨表面来源的牙周膜中确实存在干细胞,且这种干细胞具备高增殖能力,和相对于r-PDLSCs更强的矿化潜能。a-PDLSCs可以作为种子细胞应用于牙周再生的研究中。第二部分牙槽窝来源牙周膜干细胞分化潜能及牙周再生中应用的研究本实验分别在成骨诱导、成脂诱导、非诱导条件下,观察r-PDLSCs、a-PDLSCs、BMSCs三种干细胞分化能力的强弱,结果显示三种干细胞都形成了矿化结节或脂肪小滴,而定量分析结果显示,在成骨/成脂分化能力方面,a-PDLSCs要强于r-PDLSCs。将三种干细胞与CBB复合包裹纤维蛋白胶,植入裸鼠背部皮下,6周后组织学对移植物进行观察,结果显示,r-PDLSCs和a-PDLSCs的移植物均生成了牙周膜样组织和矿化组织,然而矿化组织的形态和面积存在差别。a-PDLSCs形成矿化组织的面积明显大于r-PDLSCs,且矿化组织的形态近似于BMSCs的生成物。为了进一步评价干细胞的矿化能力和骨修复能力,本实验在裸鼠颅骨人工创造了极限骨缺损,观察牙周膜干细胞植入后骨缺损修复的情况。Micro-CT结果显示,r-PDLSCs组和a-PDLSCs组都在缺损区形成了新骨,然而定量分析结果显示,a-PDLSCs形成新骨的面积要大于r-PDLSCs,说明a-PDLSCs具备更强的骨缺损修复能力。以上结果从分化能力及再生修复能力证明了a-PDLSCs的特性。a-PDLSCs相对于r-PDLSCs更强的分化能力和骨再生修复能力为其在牙周组织工程中的应用奠定了基础。