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马兜铃酸（Aristolochic acids,简称AAs）是一类硝基菲羧酸,存在于马兜铃科的马兜铃属（Aristolochia）及细辛属（Asarum）等植物中,具有不可逆的肾毒性、致癌和致基因突变作用,被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物,尤其是AAs暴露与肝癌之间具有一定的相关性。近年对巴尔干地区性肾病的朔源研究发现,AAs随着植株腐烂进入土壤,并可以被土壤后续种植的植物吸收。目前,AAs已成为一个新的世界性公共卫生问题。因此,建立高效灵敏的检测方法对含AAs的产品进行有效监测,可以有效降低人们对AAs的暴露量。目前,AAs的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）和毛细管电泳法（CE）等。这些方法虽然检测灵敏度高,但是需要购买专业的仪器设备,由专业技术人员操作,适合实验室检测分析。相比之下,基于抗原抗体特异性识别的免疫分析法具有特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点,适合大批量样品中马兜铃酸的快速筛查。因此,本研究以毒性最强、含量最高的马兜铃酸I（AAI）为对象,通过细胞融合技术制备单克隆抗体,并基于该抗体建立酶联免疫分析方法（ELISA）、荧光免疫分析方法（FIA）以及免疫层析分析方法（ICA）等,适合不同场景马兜铃酸的快速检测,取得的主要成果如下:（1）马兜铃酸I单克隆抗体制备与识别特性采用碳二亚胺法制备免疫抗原AAI-KLH免疫Balb/C小鼠,通过细胞融合,获得灵敏度高且能够稳定分泌AAI单克隆抗体的杂交瘤细胞株AAI-KLH-3A3。建立间接竞争ELISA对抗体性能进行鉴定,结果表明该抗体的半抑制浓度(IC50)为2.4 ng/m L,检测线性范围(IC20～IC80)为0.2～3.1 ng/m L,检测限(IC10)为0.1 ng/m L。该抗体与结构类似物AAⅡ的交叉反应率为86.2%,与其他结构类似物及马兜铃科植物中含量比较高的化合物交叉反应率均低于10%。计算机分子模拟结果显示:AAs 7号位的羟基是影响单克隆抗体对马兜铃酸化合物识别的关键基团。基于此建立的ic ELISA对中药材山慈菇、中成药蛇胆川贝以及减肥茶肠清茶加标回收率在88%～110%之间,变异系数≤14%。检测结果与UPLC-QQQ-MS/MS进行比对,结果显示两者相关性良好（R~2=0.997）。（2）马兜铃酸Ⅰ间接竞争化学发光酶联免疫分析方法研究研究了基于鲁米诺体系的化学发光酶联免疫检测方法（CLEIA）。通过优化包被抗原和抗体的工作浓度、工作液的离子浓度、p H、吐温-20以及甲醇含量等关键参数,所建立的CLEIA检测方法IC50为1.8 ng/m L,检测线性范围(IC20～IC80)为0.7～4.4 ng/m L,检测限（LOD）为0.4 ng/m L,特异性好。检测结果与UPLC-QQQ-MS/MS进行比对,结果显示两者相关性良好（R~2=0.999）。相比传统的ic ELISA方法,该ic CLEIA方法检测AAI具有更好灵敏度以及更宽的线性范围。（3）基于碳点增敏的荧光猝灭免疫分析方法研究为进一步提高检测方法的灵敏度,研究了基于红色碳点（r CDs）荧光猝灭的免疫检测方法（FIA）。制备了一种在540 nm波长激发下,610 nm波长发出红色荧光的碳点,氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐（ox TMB）可通过内滤作用猝灭r CDs的发射,将显色信号转化为荧光猝灭信号,进一步提高免疫分析方法灵敏度。利用制备的AAI单克隆抗体,建立基于碳点增敏的荧光猝灭免疫分析方法（r CDs-based FIA）。该方法其IC50值为0.41ng/m L,线性范围为0.14～1.12 ng/m L,检测限（LOD）为0.08 ng/m L。检测结果与UPLC-QQQ-MS/MS进行比对,结果显示两者相关性良好（R~2=0.999）,该方法检测AAI其灵敏度相比于普通ic ELISA提高了接近6倍。（4）马兜铃酸Ⅰ胶体金免疫层析方法研究为实现现场快速检测,研究了基于胶体金免疫层析的快速检测试纸条（GICA）。制备了平均粒径约为43 nm的胶体金粒子,通过静电吸附将AAI单克隆抗体与胶体金标记,构建了免疫层析检测试纸条。优化胶体金标记最适p H、标记抗体最佳使用量、C线、T线包被浓度等关键参数,结果表明该试纸条裸眼检测限为50 ng/m L,检测时间5～10 min,特异性良好、重复性高、性能稳定,检测结果与UPLC-QQQ-MS/MS进行比对,定性判定结果一致,该方法适合大批量样品的现场快速筛查。（5）马兜铃酸Ⅰ时间分辨荧光免疫层析方法研究为进一步提高免疫层析的准确定量,研究了基于时间分辨荧光的免疫层析检测方法（TRFICA）。通过羧基活化将抗体标记到时间分辨荧光微球上制备荧光探针,建立基于AAI单克隆抗体的TRFICA,该方法的IC50为8.5 ng/m L,定量范围(IC20～IC80)为3.9～18.5 ng/m L,检测限（LOD）为2.5 ng/m L,该方法特异性良好。加标回收检测结果与UPLC-QQQ-MS/MS进行对比,结果显示两者相关性良好（R~2=0.990）。综上所述,本研究制备了灵敏度高且能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株AAI-KLH-3A3。以AAI单克隆抗体为基础分别建立了适用于实验室检测的ic ELISA、CLEIA与r CDs-based FIA,以及适用于现场检测的GICA以及TRFICA。r CDs-based FIA的灵敏度最高,其次为ic CLEIA,相比传统的ic ELISA均具有更好灵敏度以及更宽的线性范围。GICA非常适用于现场的快速定性筛选,通过裸眼即可判定;TRFICA只需借助便于携带的时间分辨荧光定量仪,便可用于现场的快速定性与定量检测。本研究建立的免疫分析方法适宜不同情况下的需求,为马兜铃科植物及以马兜铃科植物为原料的产品使用监测提供有效的快速检测方法,为有效降低AAs的暴露量提供了重要技术支持。