作为植物源杀虫剂的典型代表，印楝素因为具有活性强，生物活性最稳定，对人体健康无危害，无残留，不破坏生态环境，害虫也不易对其产生抗药性等特性，而被认为是最适合于商品化开发的植物源杀虫剂。印楝素为多作用点物质，对昆虫的作用方式多种多样，其中以拒食和生长发育调节为主要作用方式。国内外有关印楝素及不断发现的新印楝化合物的生物活性被越来越多的实验和实践所证实，相关的文献已有大量的累积。但有关印楝素杀虫作用机理的研究远远滞后，在分子水平上明确印楝素作用靶标的研究几乎没有，这严重制约着印楝素农药的科学合理使用，以及印楝素的进一步改造。为此，利用新型科学技术手段阐明印楝素的作用机制，不仅可以为进一步开发和利用植物源农药提供理论指导，而且也可以为开发新型的农药提供理论基础。　　本研究以斜纹夜蛾卵巢细胞为研究对象，确定印楝素48 h作用斜纹夜蛾卵巢细胞的抑制中浓度。以此浓度处理斜纹夜蛾卵巢细胞后提取RNA，分别以处理组做为Tester，对照组做为Driver，构建斜纹夜蛾卵巢细胞应答抑制消减杂交文库，筛选斜纹夜蛾卵巢细胞应答印楝素的差异表达基因。筛选到的基因经TA连接后，大规模测序，进行EST序列分析，分析印楝素处理后斜纹夜蛾细胞的基因表达特征。对筛选到的特异基因进行全长序列扩增，在原核细胞中和真核细胞中表达，以阐明印楝素与应答差异表达基因之间的关系。　　主要研究结果如下：　　①印楝素对斜纹夜蛾卵巢细胞具有良好的增殖抑制活性。随着浓度的升高，印楝素的抑制活性也随之升高。在浓度为80μg/mL时，印楝素对斜纹夜蛾卵巢细胞处理48 h的抑制作用达到了81.31％。印楝素作用48小时对斜纹夜蛾卵巢细胞的IC50值为8.82μg/mL。该浓度做为后续消减杂交文库构建的研究浓度。　　②通过消减杂交共筛选出斜纹夜蛾卵巢细胞应答印楝素的共获得质量较好的序列270条。平均长度大于377 bp，最长序列为1193 bp，最短序列为105 bp。在这些序列中，145条ESTs(53.81％)在现有的基因数据库中有相似性序列，50条ESTs(18.48％)是未知基因，现有的数据库中尚不能进行注释，75条ESTs(27.72％)在现有的数据库中没有找到相似性序列。经基因的注释和功能分类，与NCBI数据库中已知基因有较高相似性的序列共编码53个不同基因的蛋白质，这53个不同的基因编码的蛋白质具有不同的预测功能，涉及多种代谢和应答过程，如基础代谢、细胞壁的合成和重组、能量代谢、蛋白质合成加工、DNA处理、转录、信号传导、压力反应相关蛋白等。基因簇的百分比分别为26.09％(遗传信息的处理)，11.41％(细胞生长和死亡)，7.07％(代谢)，6.52％(信号转导/运输)和2.72％(免疫力)。　　③随机选择11个候选差异基因，通过实时荧光定量PCR验证候选差异基因的表达量，结果发现在印楝素处理后斜纹夜蛾卵巢细胞的基因表达量出现不同程度的上调和下调。其中细胞中间丝(cell intermediate filament)，泛醌细胞色素C还原酶(ubiquinol-cytochrome C reductase)，细胞色素氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidaseⅠ)，染色体区域蛋白(chromosomal region maintenance1 protein)，热激蛋白90(HSP-90)，NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase)，丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)，热激蛋白70(HSP-70)，微管相关蛋白(microtubule-associated protein)和受翻译控制肿瘤蛋白(translationaIly controlled tumor protein)共10个基因在印楝素处理后表达量下调，只有脂肪酶(lipase)在经印楝素处理后表达量上调。　　④斜纹夜蛾TCTP基因的cDNA全长829 bp，编码区在92～610 bp之间，推导编码172个氨基酸。5’非翻译区长度为91 bp，3’非翻译区长度为219 bp。NCBI网站(。http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上通过Blast比较，斜纹夜蛾TCTP基因属于受翻译控制肿瘤蛋白家族，与其它物种TCTP基因有很高的相似性。　　⑤构建了pET32a-TCTP原核表达载体，经酶切和重组子测序结果表明，读码框正确，证明成功地构建了原核表达载体pET32a-TCTP。在原核表达系统大肠杆菌DE3中进行表达，IPTG诱导后均产生了约蛋白质分子量为20 KDa的目的蛋白，与理论上预期的分子量大小相符。确定了1 mM IPTG诱导4 h是重组蛋白表达的最佳优化条件。通过western blotting验证了SLTCTP重组蛋白在大肠杆菌BL21中的表达。　　⑥通过Bac-to-Bac表达系统构建pDEST10-TCTP真核表达载体，再将其转化入含穿梭载体Bacmid的受体大肠杆菌DH5α中，通过转座作用，经多重抗性和蓝白斑筛选后，得到杆状重组病毒Bacmid-TCTP的DNA。Transfuge()HD转染试剂介导在粉纹夜蛾卵巢细胞中进行表达，印楝素处理24小时后，转染48 h的粉纹夜蛾卵巢细胞中TCTP表达量明显下调。　　综上所述，获得了大量与斜纹夜蛾卵巢细胞应答印楝素有关的差异基因，这为研究印楝素的分子作用机制提供便利。特异基因TCTP可能作为关键基因参与了斜纹夜蛾卵巢细胞应答印楝素的进程。