目的:肝细胞癌是一种世界范围内常见的恶性肿瘤,其死亡率占肿瘤相关死亡率的第三位。尽管以手术治疗为主的综合治疗提高了肝细胞癌患者的5年生存率,但肝细胞癌的发病机制十分复杂,缺乏特异性强和灵敏度高的生物学标记物,肝细胞癌患者5年生存率仅为15.0%-45.7%。因此深入研究肝细胞癌的分子生物学机制,寻求特异的诊断治疗靶点,是目前肝细胞癌研究的重点。micro RNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中的非编码小片段RNA,其通过调节靶基因的表达进而广泛参与机体的各项生理、病理过程中。miR-187-3p是miR-187家族的一员,定位于人染色体18q12.2。已有研究报道在结直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌、食管腺癌中miR-187-3p呈低表达,这些研究表明miR-187-3p在人类肿瘤发生发展中发挥着抑癌基因的作用。然而,也有实验证实miR-187-3p在外周T细胞淋巴瘤中高表达,并且miR-187-3p能增加乳腺癌细胞的侵袭能力,与乳腺癌患者的预后有关。因此,在不同的肿瘤组织中miR-187-3p发挥的作用可能不同。但是miR-187-3p在肝细胞癌组织中的表达状况及作用报道较少。本研究通过miRNA芯片杂交技术筛选新鲜肝细胞癌组织中差异表达的miRNA,然后通过实时荧光定量PCR检测miR-187-3p的表达情况,并结合患者临床资料、生存期资料及病理学特征分析miR-187-3p在肝细胞癌发生发展、临床诊断以及预后评估中的意义,为miR-187-3p在临床中的应用提供理论依据。方法:1研究对象及标本选取2010年4月至2016年8月于河北医科大学第四医院肝胆外科行手术切除的肝细胞癌患者90例,其中男性75例,女性15例,年龄25-78岁。依据手术前一周实验室的指标、Child-Pugh分级标准评估肝功能,同时确定肿瘤标记物水平和肝炎类型,并根据影像学检查和术中情况评估肝硬化严重程度以及肿瘤特征。90例患者中肿瘤直径2-25cm。肝功能Child A级87例,B级3例。临床分期Ⅰ期39例、Ⅱ期29例,Ⅲ期22例。本实验中患者乙肝表面抗原(HBs Ag)阳性74例,阴性16例。所有研究对象在手术前均未进行过放疗、化疗或其它抗肿瘤治疗。研究标本共180例,其中新鲜肝细胞癌组织标本90例及相对应癌旁组织90例。标本提取后立即保存于液氮中,然后储存于-80℃低温冰箱中以备实验使用。所有标本均经过常规石蜡包埋,HE染色,最终由2位病理科医师进行组织学诊断。收集患者肝炎病史、饮酒史、吸烟史以及家族史等资料,记录患者肝功能、AFP值、血常规、凝血功能、甲乙丙肝炎等实验室指标,登记患者肿瘤病理类型、肿瘤大小和数目、门静脉及其分支是否存在瘤栓等病理学资料。通过电话联系或信访等途径对患者进行随访,随访开始时间即为患者手术日,随访截止时间为2016年10月11日。2 miRNA芯片杂交技术从90例肝细胞癌患者中选取5例利用引物Poly(A)Tailing反转录符合标准的总RNA,然后进行miRNA芯片杂交、洗涤、扫描、最终生成数据。最后进行生物信息学分析以及应用互联网上miRNA靶基因预测软件(Targetscan、Mi Randa)在线服务站点,输出表达差异miRNA的预测靶基因,取2个软件预测靶基因的交集(实验由上海其明生物信息有限公司协助完成)。3检测肝细胞癌组织和癌旁组织中miR-187-3p的表达情况利用Trizol法提取组织总RNA,对RNA进行纯度、完整性和浓度的测定,然后将符合标准的RNA反转录为c DNA,再采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术检测90对肝细胞癌组织标本及配对的癌旁组织标本中miR-187-3p表达情况。miR-187-3p特异性茎环反转录引物:5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC CCGGCTGC-3’;U6特异性茎环反转录引物:5’-AACGCTTCACGAAT TTGCGT-3’。miR-187-3p实时荧光定量PCR上游引物:5’-GTGCAGGGT CCGAGGTATT-3’;下游引物:5’-GCCGCTCGTGTCTTGTGTTGCAGC-3’。U6实时荧光定量PCR上游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;下游引物:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。4统计学分析统计学分析使用统计软件SPSS 21.0,实验数据正态性分布检验采用Kolmogorov-Smimov法。计数资料采用χ2检验或Fisher精确检验,两组间的配对样本采用Wilcoxon检验。生存分析使用Kaplan-Meier法,用Log-rank检验进行单因素分析,用COX回归模型进行多因素分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1肝细胞癌组织中miRNA表达谱分析运用miRNA芯片杂交技术,在5对肝细胞癌及相应癌旁组织中筛选出差异表达在2倍以上的miRNA共148个,其中102个miRNAs在肝细胞癌组织较癌旁组织表达下调,46个miRNAs在肝细胞癌组织较癌旁组织表达上调(实验由上海其明生物信息有限公司协助完成)。2肝细胞癌组织及相应癌旁组织中miR-187-3p的相对表达量及比较在90例肝细胞癌患者中有63例(70.0%)癌组织中miR-187-3p相对于癌旁组织表达量下降,且差异具有统计学意义(Z=-2.891,P=0.004);说明miR-187-3p在肝细胞癌组织中的表达显著低于癌旁组织,这与miRNA芯片结果相一致。3肝细胞癌患者中miR-187-3p的表达状态与临床病理特征的关系肝细胞癌患者中miR-187-3p的异常表达与肿瘤大小、临床分期显著相关(P<0.05)。在肿瘤直径≥5cm的患者中miR-187-3p表达下调的阳性率为(75.0%),肿瘤直径<5cm的患者中miR-187-3p表达下调的阳性率为(59.1%),其差别具有统计学意义(P=0.017);在临床分期Ⅰ期患者中miR-187-3p表达下调的阳性率为(69.2%),Ⅱ期患者中miR-187-3p表达下调的阳性率为(79.3%),Ⅲ期患者中miR-187-3p表达下调的阳性率为(59.1%),差异具有统计学意义(P=0.002);但在不同性别(P=0.119)、年龄(P=0.976)、乙肝表面抗原(P=0.342)、门静脉及其分支瘤栓(P=0.392)、肿瘤个数(P=0.867)、AFP水平(P=0.198)组别之间差异无显著相关性。4 miR-187-3p的表达状态与肝细胞癌患者术后生存期预后的关系Kaplan-Meier生存分析表明miR-187-3p表达下调的肝细胞癌患者的1年、3年、5年生存率为87.8%、56.2%、24.7%,平均生存时间40.470±4.407个月;上调者的1年生存率为90%,平均生存时间64.600±4.996个月,差异有统计学意义(P=0.011)。门静脉及其分支有瘤栓患者的1年生存率为50.9%,平均生存时间17.568±2.326个月,中位生存时间19个月;无瘤栓患者的1年、3年、5年生存率为93.8%、68.4%、59.3%,平均生存时间51.266±4.164个月,中位生存时间70个月,两者间差异有统计学意义(P=0.005)。肿瘤直径<5cm患者的1年生存率为82.9%,平均生存时间58.802±5.791个月,中位生存时间70个月;肿瘤直径≥5cm患者的1年、3年、5年生存率为95%、59.9%、37.2%,平均生存时间41.713±4.606个月,中位生存时间26个月,两者之间的差异有统计学意义(P=0.032)。临床分期Ⅰ期患者的1年、3年生存率86.4%、47.8%,平均生存时间58.629±5.203个月;Ⅱ期患者1年生存率为77.6%,平均生存时间30.593±6.290个月;Ⅲ期患者1年生存率为56.8%,平均生存时间20.729±1.914个月,三者之间差异具有统计学意义(P=0.001)。Child-Pugh分级为A级患者的1年、3年、5年生存率为97.5%、71.2%、63.3%,平均生存时间47.109±3.984个月,中位生存时间63个月;Child-Pugh分级为B级患者的1年、3年、5年生存率为0%,平均生存时间19.667±6.006个月,中位生存时间26个月,两者间差异无统计学意义(P=0.437)。年龄<60岁的1年、3年生存率分别为88.9%、62.3%,平均生存时间49.916±4.785个月;年龄≥60岁的1年生存率为78.5%,平均生存时间39.836±6.172个月,两者间差异无统计学意义(P=0.441)。进一步分析肝细胞癌患者术后总生存期的独立危险因子,我们将miR-187-3p表达水平、临床分期、肿瘤大小等影响因素进行多因素COX回归模型分析,结果显示miR-187-3p表达水平、肿瘤个数、临床分期是影响肝细胞癌患者术后总生存期的独立危险因子(P均<0.05),其余参数P值均大于0.05。结论:1肝细胞癌组织中存在差异表达的miRNAs,其中miR-187-3p在肝细胞癌组织中的表达较相应癌旁组织表达下调,表明miR-187-3p可能参与了肝细胞癌的发生与发展。2 miR-187-3p的差异表达与肝细胞癌患者肿瘤大小、临床分期有关,表明miR-187-3p异常表达一定程度上反应肝细胞癌患者的病情变化。3 miR-187-3p的表达状态、肿瘤个数、临床分期可作为肝细胞癌患者术后总生存期的独立危险因子,可作为肝细胞癌患者判断预后的指标。