研究背景:随着人口的老龄化,生活方式的改变,我国结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的发病率及死亡率在过去的20年持续增长,严重威胁居民健康。随着对CRC生物学机制研究的深入和新型药物的应用,目前CRC的临床疗效显著提高,但复发及转移依然是导致CRC患者死亡的主要原因。针对CRC的新型靶点选择及药物研发依然是目前研究的重点。微小RNA(micro-RNAs,mi-RNAs)是一种内源性非编码RNA,可调控基因的转录与翻译,发挥促进或抑制肿瘤生长的作用。研究表明,miR-215参与了多种恶性肿瘤的发生和发展,其中miR-215的3p成熟体被认为可通过调控内源性趋化因子受体1(CXC-chemokine receptor type1,CXCR1)逆转CRC对5-Fu的耐药,提示miR-215-3p可能抑制CRC的发生与发展。但目前miR-215-3p调控CRC增殖及侵袭的具体机制尚未完全阐明。叉头框M1转录因子(forkhead box Protein M1,FoxM1)是一种增殖特异性转录调节蛋白,在多种恶性肿瘤中呈高表达,并与肿瘤的进展和预后有显著相关性。有证据显示,FoxM1可能作为miRNA-215-3p的下游蛋白,参与CRC的生物学调控。本课题主要研究miR-215-3p在CRC中的表达及与临床预后的相关性,同时通过观察miRNA-215-3p是否通过靶向调控FoxM1蛋白水平对CRC细胞增殖及侵袭产生影响。这一研究结果将证明miR-215-3p是否可以作为CRC进展的新的分子标志物,为今后新的治疗靶点的选择提供实验和理论依据。第一部分:miRNA-215-3p在结直肠癌中的表达及意义研究目的:检测miR-215-3p在CRC组织中的表达,分析其与患者临床病理特征及预后的相关性。研究方法:(1)收集安徽医科大学第二附属医院48例原发性CRC组织及相应癌旁正常组织。采用qRT-PCR法检测各组织中miR-215-3p表达,分析miR-215-3p表达与CRC患者临床病理特征的相关性。(2)依据miR-215-3p表达量的平均水平,将CRC患者分为miR-215-3p高表达组和miR-215-3p低表达组,比较两组患者的总生存期的差异。研究结果:(1)48例CRC患者中,miR-215-3p在肿瘤组织中的表达水平显著低于相应癌旁正常组织(P<0.01)。(2)miR-215-3p的表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.01),相比之下,与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学类型无关(P>0.05)。(3)30例miR-215-3p低表达患者的中位总生存期为65个月,18例miR-215-3p高表达患者的中位总生存期为87个月,Kaplan-Meier生存曲线结果显示miR-215-3p高表达组患者较低表达组有更长的总生存期,差异有显著意义(χ~2=6.317,P=0.012)。研究结论:miR-215-3p在CRC患者肿瘤组织中低表达,且与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移负相关,miR-215-3p高表达组患者预后更好,提示miR-215-3p可能扮演抑癌基因角色参与调控CRC恶性化进程,其表达上调是评估患者预后良好的一个潜在指标。第二部分:高表达miRNA-215-3p抑制结直肠癌细胞恶性生物学行为研究目的:观察miR-215-3p对CRC细胞恶性生物学行为调控的影响。研究方法:(1)采用qRT-PCR法检测正常结肠上皮细胞系HCoEpiC细胞及CRC细胞系SW480、HT-29和LOVO细胞中miR-215-3p的表达水平。(2)分别将SW480、HT-29细胞各自分为三组,control组:SW480及HT-29细胞作为空白对照组;miR-NC组:将scramble分别转染SW480、HT-29细胞;miR-215-3p组:将miR-215-3p分别转染SW480、HT-29细胞。qRT-PCR法检测上述转染后细胞中miR-215-3p表达。MTT比色法检测细胞增殖活性,细胞集落形成实验检测细胞克隆形成能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。(3)将SW480细胞随机分为2组,miR-NC组:将scramble转染SW480细胞;miR-215-3p组:将miR-215-3p转染SW480细胞。qRT-PCR法检测两组转染后细胞中miR-215-3p表达。将两组细胞分别接种裸鼠右侧背部皮肤,建立CRC移植瘤模型,比较两组裸鼠移植瘤体积大小并绘制移植瘤生长曲线,第5周时处死裸鼠完整取出移植瘤组织称重比较。将分别转染miR-NC和miR-215-3p的SW480细胞经裸鼠尾静脉注入5周龄裸鼠体内人为造成肺转移模型,接种2周后处死裸鼠取出双肺,观察双肺转移瘤的集落数。研究结果:(1)相对于HCoEpiC细胞,SW480、HT-29和LOVO细胞中miR-215-3p的表达水平均显著降低(P<0.01)。(2)转染miR-215-3p后,SW480细胞中miR-215-3p表达量是control组15倍,两者比较差异有非常显著意义(P<0.01);HT-29细胞中miR-215-3p表达量是control组10倍,两者比较差异有非常显著意义(P<0.01)。(3)相对于Control组,SW480细胞及HT-29细胞增殖活性明显降低、克隆形成数量明显减少、迁移及侵袭能力明显下降,差异有非常显著意义(P<0.01)。(4)相对于miR-NC组,miR-215-3p组裸鼠移植瘤体积及重量明显减小,双肺转移瘤集落数明显减少,差异有非常显著意义(P<0.01)。研究结论:本实验进一步证实了miR-215-3p在CRC组织中呈低表达,在体外细胞实验以及移植瘤动物模型中,miR-215-3p的高表达可显著抑制CRC细胞增殖失控,迁移侵袭等恶性生物学行为,miR-215-3p发挥了抑癌基因效应。第三部分:miRNA-215-3p靶向FoxM1抑制结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的实验研究研究目的:探讨miR-215-3p调控CRC恶性化进程的具体作用机制。研究方法:(1)选择TargetScan生物信息学软件分析预测能够与miR-215-3p结合的靶基因,采用pGL3-promoter vector构建wt-FoxM1质粒与mut-FoxM1质粒,使用Lipofectamine?2000转染试剂分别将wt-FoxM1质粒与scramble或miR-215-3p共转染HEK-293T细胞;将mut-FoxM1质粒与scramble或miR-215-3p共转染HEK-293T细胞。双荧光素酶报告系统验证miR-215-3p与FoxM1之间的靶向调控相关性。(2)采用qRT-PCR法及Western blot法检测miR-215-3p调控下FoxM1的mRNA及蛋白表达量情况。(3)将siFoxM1转染SW480细胞,western blot法证实FoxM1基因敲低,后采用MTT比色法检测细胞增殖活性,细胞集落形成实验检测细胞克隆形成能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。(4)将FoxM1转染SW480细胞,western blot法验证恢复内源性FoxM1的水平,MTT比色法检测细胞增殖活性,细胞集落形成实验检测细胞克隆形成能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。研究结果:(1)TargetScan生物信息学软件分析结果表明miR-215-3p能够与FoxM13非翻译区域结合,FoxM1是miR-215-3p的潜在靶点。在转染wt-FoxM1表达载体的细胞中,相对于miR-NC组,miR-215-3p组细胞荧光素酶的活性明显减少(P<0.01)。而在转染mut-FoxM1表达载体的细胞中,相对于miR-NC组,miR-215-3p组细胞荧光素酶的活性无明显变化(P>0.05),双荧光素酶报告系统验证FoxM1是miR-215-3p的直接作用靶点。(2)Western blot实验结果证实,miR-215-3p高表达能显著减少人CRC细胞系SW480及HT-29细胞中FoxM1的蛋白表达量。Pearson相关系数和TCGA数据库均表明miR-215-3p与FoxM1在CRC组织中表达呈负相关(R~2=0.1244,P=0.0139)。(3)通过转染siRNA对抗FoxM1,降低siFoxM1组SW480细胞中FoxM1蛋白的表达,在SW480细胞中,相对于Control组,FoxM1敲低后细胞的增殖活性、克隆形成数量、迁移侵袭能力均明显降低,差异有非常显著意义(P<0.01)。(4)FoxM1的重新表达恢复了SW480细胞内源性FoxM1的水平,相对于Control组,转染miR-215-3p组细胞增殖活性、克隆形成数量、迁移侵袭能力均明显降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。相对于miR-215-3p组,转染miR-215-3p+FoxM1组细胞增殖活性、克隆形成数量、迁移侵袭能力均明显增强,差异有非常显著意义(P<0.01)。研究结论:miR-215-3p可直接靶向调控FoxM1,二者表达水平呈负相关。FoxM1敲低可显著抑制CRC细胞恶性化进程,FoxM1重新表达逆转了miR-215-3p依赖的表型,miR-215-3p可能通过靶向FoxM1而参与到CRC细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为的调控。