结直肠癌是全球发病率及死亡率排名第三的恶性肿瘤。结直肠癌的发生发展与炎症息息相关。炎症参与肿瘤的发生、发展已受到广泛认可,被认为是肿瘤的标志之一。多种慢性炎症与肿瘤的发生、发展有关。如肝炎病毒感染与肝癌、幽门螺旋杆菌感染与胃癌、炎性肠病与结直肠癌等等。有研究证据表明,炎性肠病病人患结直肠癌的风险大大增加。炎性肠病主要分为克罗恩氏病和溃疡性结肠炎,目前这些炎性肠病的发病机制还不完全清楚。临床上使用非甾体类抗体药物如阿司匹林预防肿瘤发生已经取得很好效果,尤其是炎性肠病患者使用这类药物能减少结肠癌的发生。这也说明炎症在结直肠癌的发生发展中发挥了极其重要的作用。炎症微环境导致DNA发生突变的概率增加;炎症细胞产生大量的活性氧类和活性氮中间体,诱导DNA发生损伤导致基因组的不稳定性增加。炎症中炎性因子的分泌增加,能够活化核转录因子NF-κB、信号传导与转录活化因子STATs、激活蛋白AP-1、丝裂原活化蛋白激酶MAPKs等信号通路,进而激活细胞的增殖、促进新生血管生成、促进炎症因子和趋化因子等促炎因子分泌,通过上述步骤促进肿瘤的发生及进展。STAT3在炎症微环境中的异常活化介导炎症介质的细胞外信号调控肿瘤细胞、免疫细胞等生物学行为,从而大大促进炎-癌转化过程。JWA基因在抑制胃癌和黑色素瘤血管生成发挥了活跃的生物学功能,并且还可以通过MAPK-E2F1-XRCC1信号通路参与修复氧化应激诱导的DNA单链损伤。JWA作为新的丝裂原激活蛋白,通过调控MAPK信号通路调控细胞的微丝微管重组,影响细胞迁移能力。高通量基因芯片数据显示,在JWA缺失小鼠及细胞中,E2F1调控的下游靶基因表达显著降低,提示JWA对E2F1的正向调控作用,但E2F1在肠炎及炎症相关肠癌中的作用还不清楚。本研究中,我们通过体内体外不同干预手段探讨JWA调控结肠炎症及炎症相关结肠癌的确切分子机制。目的:探讨E2F1在JWA调控的结肠炎症及炎症相关结肠肿瘤过程中的作用及确切分子机制,为防治炎症相关肿瘤提供新的科学依据。方法:构建E2F1 Tet-on3G系统转基因小鼠,通过强力霉素控制升高小鼠体内E2F1表达;采用AOM/DSS诱导的E2F1转基因小鼠急性结肠炎症模型,观察E2F1对结肠炎-癌转化结局的影响,观察两种基因型小鼠成瘤数量;采用DSS诱导的E2F1转基因小鼠DSS急性结肠炎症模型,观察E2F1对结肠炎症发生的影响,观察两种基因型小鼠炎症期间体重丢失情况和结肠缩短程度,免疫印迹法检测STAT3信号通路分子表达情况;细胞模型中通过免疫印迹、实时荧光定量PCR、染色质免疫共沉淀ChIP实验验证JWA通过E2F1转录调控STAT3表达;构建STAT3抑制剂S3I-201干预E2F1转基因小鼠DSS急性结肠炎症模型,观察抑制STAT3通路对小鼠炎症程度影响;采用蛋白免疫印迹检测JWA、E2F1、STAT3在正常结肠、炎症、不典型增生、肿瘤组织中的表达;采用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR检测JWA、E2F1、STAT3在人结肠肿瘤癌组织及相应癌旁组织的表达;构建JWA干扰慢病毒JWA-RNAi干预小鼠DSS急性结肠炎症模型,观察小鼠炎症期间体重丢失情况和结肠缩短程度。结果:1.E2F1促进结肠炎症及相关肿瘤的形成1)将成功构建的E2F1 Tet-on 3G系统调控载体和反应载体利用显微注射方式将注射到FVB背景小鼠受精卵的原核内,子代阳性小鼠与CMV-Cre工具鼠杂交,剔除调控载体中的“LoxP-Stop-LoxP”序列,获得小鼠自交/回交至少5代后,得到C57BL/6背景的纯合的E2F1 Tet-on 3G转基因小鼠（E2F1Tg/Tg,基因型为 E2F1Tet+/+TRE+/+Cre+/+）。在强力霉素诱导下,E2F1Tg/Tg小鼠体内E2F1表达水平增高。2)饲喂E2F1+/+和E2F1Tg/Tg小鼠强力霉素5%葡萄糖溶液一周,小动物活体成像仪检测小鼠体内自发红色荧光水平。结果发现,饲喂强力霉素显著升高E2F1Tg/Tg小鼠体内红色荧光表达。Western blot检测小鼠饲喂DOX后结肠及脾脏组织中E2F1表达情况,结果显示E2F1Tg/Tg小鼠结肠、脾脏中E2F1表达显著高于E2F1+/+小鼠,结肠和脾脏中E2F1表达水平分别增高4.82和3.94 倍。3)E2F1转基因小鼠AOM/DSS模型结果发现E2F1高表达可以促进结肠炎相关肿瘤的形成。每组8只小鼠,E2F1+/+组仅2只小鼠出现小息肉状不典型增生,而E2F1Tg/Tg组7只发现有明显的肉眼可见肿瘤形成;E2F1+/+小鼠肿瘤数为0.25个/只小鼠E2F1 Tg/Tg小鼠肿瘤数为1.75个/只小鼠,是E2F1+/+小鼠的7倍;E2F1Tg/Tg小鼠在第二次及第三次DSS饮水处理结肠发生急性炎症反应时,体重丢失更显著。4)E2F1转基因小鼠DSS急性肠炎模型结果发现E2F1高表达可以促进结肠炎症。E2F1 Tg/Tg小鼠体重下降程度显著高于E2F1+/+小鼠;E2F1Tg/Tg小鼠较E2F1+/+小鼠结肠缩短16%;出现腹泻、粪便隐血等急性肠炎体征也早于E2F1+/+小鼠。结肠组织HE染色结果显示DSS处理的E2F1Tg/Tg及E2F1+/+小鼠结肠黏膜均呈现明显的急性炎症反应;E2F1Tg/Tg小鼠的肠上皮损伤更严重,呈弥漫性溃疡病变,肠上皮脱落,局部黏膜层细胞坏死,炎症细胞浸润相对于E2F1+/+小鼠更多。2.E2F1高表达促进促炎因子及趋化因子的释放1)DOX饲喂小鼠后,E2F1Tg/Tg小鼠结肠组织中E2F1蛋白也显著被激活表达上调,较E2F1+/+小鼠表达升高12.73倍;E2F1Tg/Tg小鼠结肠炎症组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、HGF、IL-17α等促炎因子表达显著高于E2F1+/+小鼠;抑炎因子IL-10在两组小鼠结肠炎症组织中表达差异不显著;小鼠趋化因子KC、MIP-2和MCP-1蛋白在DSS处理后表达也显著升高,且E2F1 Tg/Tg小鼠相较于E2F1+/+小鼠这些趋化因子表达量更高。3.JWA通过E2F1正调控STAT3表达水平1)JWA敲基因小鼠急性肠炎模型检测DSS处理后JWA+/+和JWAΔ2/Δ2小鼠结肠组织中本底及磷酸化STAT3表达水平,JWA缺失抑制DSS引起的STAT3磷酸化激活,JWA+/+小鼠结肠组织STAT3本底和p-STAT3表达水平分别是JWAΔ2/Δ2小鼠的5.78、3.87倍;并且同步检测STAT家族其他成员STAT1和STAT5,表达无明显差异。2)提取E2F1转基因小鼠急性肠炎模型结肠组织蛋白进行免疫印迹分析,结果发现E2F1Tg/Tg小鼠结肠组织中STAT3本底水平显著高于E2F1+/+小鼠,表达升高2.41倍;DSS处理后STAT3明显被激活,并且在E2F1 Tg/Tg小鼠中p-STAT3表达升高更显著,表达升高5.23倍。3)细胞模型结果证实JWA从转录和翻译水平均正调控E2F1和STAT3的蛋白和mRNA表达水平。在FHC细胞中E2F1也正调控STAT3蛋白及mRNA水平。4)通过免疫印迹、实时荧光定量PCR、染色质免疫共沉淀实验证实E2F1通过与STAT3启动子区绑定,从而上调STAT3的表达。并且升高细胞中JWA表达促进E2F1与STAT3启动子结合能力。4.抑制STAT3通路活性能显著抵抗DSS诱导的结肠炎症1)使用S3I-201抑制STAT3信号通路后,E2F1Tg/Tg小鼠和E2F1+/+小鼠炎症均有明显的减轻,结肠缩短程度也显著减小。2)HE染色结果也显示S3I-201能显著逆转E2F1Tg/Tg小鼠由DSS诱导的急性肠炎,表现为结肠上皮脱落减少、肠隐窝消失减少以及炎症细胞浸润减少。3)小鼠结肠组织免疫印迹分析发现STAT3抑制剂并不影响其本底表达,但能够显著抑制STAT3的磷酸化。4)检测E2F1Tg/Tg小鼠DSS处理组及DSS联合S3I-201干预组炎症因子表达情况,发现IL6和HGF在S3I-201处理组小鼠组表达显著降低。5.JWA影响炎症引起的肠道菌群失衡1)对JWAΔ2/Δ2小鼠和JWA+/+小鼠平静状态及炎症状态下肠道微生物16S rRNA丰度、多样性研究发现,平静状态下两组小鼠的菌群丰度和多样性无显著差异,但在炎症发生时可以显著降低肠道菌群的数量及种类,但JWA缺失可以部分抵抗炎症引起的肠道菌群多样性及丰度下降。6.JWA促进肠癌细胞增殖1)通过细胞平板克隆实验发现,肠癌细胞中高表达JWA能够促进细胞克隆形成,而低表达JWA后细胞克隆数显著减少。结果说明JWA能够促进肠癌细胞的增殖能力促进细胞的集落形成。7.JWA-E2F1-STAT3在肠癌组织中表达呈正相关1)免疫印迹法和实时荧光定量PCR检测7对新鲜结肠癌以及配对癌旁组织中的JWA、E2F1、STAT3蛋白和mRNA表达水平,均在癌组织中高表达,三者表达呈正相关趋势。8.JWA-RNAi有效抑制DSS诱发的小鼠肠炎1)构建JWA干扰慢病毒JWA-RNAi,并鉴定在细胞及小鼠的感染效率,通过预实验选择腹腔注射方式感染小鼠。2)通过腹腔注射不同剂量感染小鼠构建急性DSS炎症模型,结果发现JWA-RNAi 能显著降低小鼠 JWA 表达水平,并与注射剂量呈剂量依赖效应,剂量越大,JWA表达越低;小鼠结直肠炎症程度也随JWA表达逐渐降低而逐渐减轻。结论:综上所述,本研究首次发现和证实JWA-MEK/ERK-E2F1-STAT3信号通路对结肠炎癌转化过程的调节作用。围绕JWA、E2F1和STAT3三个关键分子,在结肠炎-癌转化不同阶段使用多种干预手段阐明了 JWA通过MEK-E2F1-STAT3信号通路促进了肠炎及炎症相关肿瘤的形成过程。并且发现JWA还能通过影响炎症状态下肠道微生物的多样性和丰度参与肠道炎症反应过程。研究结果为阐明结肠炎癌转化的分子机制提供了新的学术依据,研究结果具有潜在的转化医学价值。