前言乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率居妇科肿瘤的首位。乳腺癌的发生是一个多基因、多步骤的过程,涉及多种癌基因、肿瘤抑制基因和DNA甲基化等遗传学和表观遗传学的改变。Hh信号通路对人类的胚胎期的组织发育起着非常关键的作用,它能决定四肢的左右对称性和前后轴的形成,以及大脑、脊髓、颅面结构、肺、牙齿和眼睛等器官的模式。近几年的研究发现Hh信号的激活与包括乳腺癌在内的多种人类恶性肿瘤的发生和发展密切相关。目前,在哺乳动物体内的三种Hh同源物质中,以Sonic hedgehog(Shh)最受到关注。现在的观点认为,细胞分泌的Shh分子与其受体Patched(PTCH1和PTCH2)结合后,Patched的伙伴分子Smoothened摆脱了Patched对它的抑制,从而激发了一系列的通路级联事件。已有研究表明Shh在乳腺癌中的表达上调,但是未对其过度表达的原因进行分析,因此本研究主要目的就是检测Shh在乳腺癌及癌旁组织中的表达水平,分析它们与乳腺癌临床病理因素的关系,并初步探讨了Shh在乳腺癌中表达异常的可能机制。材料与方法1、本研究选取了97例乳腺癌标本以及22例癌旁乳腺组织标本,均来自中国医科大学附属第一临床学院2004-2007年肿瘤外科手术切除的标本蜡块,采用SP免疫组织化学的方法对组织中Shh的表达进行检测及评分,分析Shh与临床病理学指数的关系。同时利用Western blotting的方法对三种乳腺癌细胞系MDA-MB-435、MDA-MB-231、MCF-7以及正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中Shh的表达进行检测。2、从乳腺组织标本中提取DNA,包括61例乳腺癌标本以及15例癌旁乳腺组织标本,进行特异性甲基化PCR(MS-PCR),在癌旁乳腺组织及癌组织中检测Shh启动子甲基化的水平,探讨Shh启动子的甲基化与Shh表达水平异常的关系。同时利用MS-PCR检测四种细胞系中Shh启动子的甲基化状态,并应用去甲基化试剂5-氮杂胞苷,观察细胞系中Shh的表达变化。3、选取了95例乳腺癌标本以及11例癌旁乳腺组织标本,采用S-P免疫组织化学方法对组织中NF-κB的表达进行检测,分析NF-κB的表达与Shh表达之间的相关性。4、应用MTT、流式细胞术等方法检测Shh信号通路的特异性阻滞剂Cyclopamine对乳腺癌细胞系MDA-MB-435和MCF-7在增殖及凋亡方面的影响。实验结果1、Shh主要在细胞浆中表达。在癌旁乳腺导管上皮组织中,Shh平均染色强度为2.95±1.91,而在癌组织中平均染色强度为5.25±2.88。统计学分析显示癌组织中Shh的表达水平要明显高于癌旁组织(P＜0.001)。在22例癌旁组织中有18例(81.8%)表达为阴性,有4例(18.2%)表达为阳性,而在97例肿瘤组织中,47例(48.5%)表达为阴性,有50例(51.5%)表达为阳性,统计学分析显示癌组织中Shh的表达阳性率要明显高于癌旁组织(P=0.005)。Shh的表达水平与临床分期呈明显的负相关,与肿瘤抑制基因p53表达呈正相关性。在正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中Shh表达很低,在MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435三种乳腺癌细胞中也都有Shh表达,表达水平由高到低分别是MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435。2、MS-PCR结果显示在33例Shh表达阴性的样本中,有19例(57.6%)发生了启动子甲基化。相反的,在28例Shh表达阳性的样本中,只有4例(14.3%)发生了启动子甲基化。发生甲基化的标本多数是癌旁乳腺导管上皮组织,同时伴随着Shh蛋白的低水平表达,而多数肿瘤组织样本没有甲基化现象的发生,Shh蛋白则出现较强表达。5-氮杂胞苷(20μM)处理72小时后,无论是MDA-MB-435细胞还是MCF-10A细胞的Shh启动子区域甲基化程度都明显减弱,且Shh蛋白表达水平明显升高。3、乳腺组织中NF-κB的表达水平与Shh的表达水平呈明显的正相关(P＜0.001)。在56例Shh表达阴性的样本中,有37例(66.1%)同时伴有NF-κB的表达下调。相反的,在49例Shh表达阳性的样本中,只有35例(71.4%)也同时伴有NF-κB的表达上调。4、不同浓度的Cyclopamine作用于乳腺癌细胞系72h后进行MTT检测,结果显示Cyclopamine可抑制MCF-7和MDA-MB-435细胞的增殖。20μmol/L的Cyclopamine作用72h后,对MCF-7细胞的细胞周期没有任何影响,也没有诱导细胞凋亡的产生,而当Cyclopamine(20μmol/L)处理MDA-MB-435细胞72 h后,MDA-MB-435出现了明显的凋亡峰。流式细胞仪分析了细胞线粒体膜电位的结果表明20μmol/L的Cyclopamine作用72h后,MDA-MB-435细胞的线粒体膜电位降低37%。结论1、Shh在乳腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁乳腺上皮组织;Shh的表达水平与临床分期呈负相关,与p53蛋白表达呈正相关。2、Shh启动子甲基化的状态与Shh的表达水平密切相关,提示启动子甲基化可能是影响Shh表达水平的重要调节机制;DNA去甲基化试剂5-氮杂胞苷可降低乳腺细胞Shh启动子甲基化水平并增加Shh蛋白表达。3、乳腺癌组织中NF-κB表达水平与Shh呈明显的正相关,这提示NF-κB表达异常可能是导致Shh过度表达的原因之一。4、Shh信号通路阻滞剂Cyclopamine能明显抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-435的增殖,且呈剂量依赖性;Cyclopamine能诱导MDA-MB-435细胞发生凋亡,并使MDA-MB-435细胞线粒体膜电位明显降低;Cyclopamine对MCF-7和MDA-MB-435细胞周期无明显影响。