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PC-1基因是本实验室周建光研究员发现并克隆得到的一个TPD52家族的新成员,是一个雄激素应答基因,在人前列腺组织中特异表达。PC-1在早期非转移、雄激素依赖前列腺癌LNCaP细胞中低表达而在晚期雄激素非依赖且骨转移的C4-2细胞中高表达;对前列腺癌的临床组织样本的免疫组化检测表明,PC-1随着前列腺癌分级的增加表达升高。因此本实验室前期研究了这个基因在前列腺癌进展中的作用,发现PC-1基因表达可促进前列腺癌细胞增殖,促进前列腺癌细胞雄激素非依赖性生长,促进前列腺癌的恶性进展。这些研究表明PC-1具有癌基因的性质。但PC-1在临床药物治疗以及放射治疗中的作用还不明确,PC-1发挥生物学作用所涉及的下游分子及详细的分子机制没有研究清楚。为此,我们进行了一系列实验以确定PC-1的重要生物学意义及其所参与的分子事件,取得了如下主要进展:(1)用前列腺癌内分泌治疗药物雄激素拮抗剂casodex作用PC-1不同表达水平的前列腺癌细胞,发现PC-1基因表达在抗雄激素药物作用下依然促进前列腺癌细胞生长,表明PC-1可以拮抗抗雄激素药物对前列腺癌生长的抑制作用。同时检测了一些生长调控因子表达的变化,发现PC-1调节如Rb、cyclinE、p21和p27等重要细胞周期相关基因的表达,表明PC-1可能通过调节细胞周期调控因子参与细胞周期进程从而拮抗抗雄激素药物的作用。(2)进一步检测了PC-1对抗肿瘤药物LY294002和rapamycin(雷帕霉素)耐药性的影响,发现PC-1表达并不影响LY294002对前列腺癌细胞的抑制作用;而RNAi沉默PC-1表达和rapamycin联合使用可以显著抑制前列腺癌细胞的生长,与此对应PC-1高表达可以显著抑制rapamycin所诱发的细胞G0/G1期阻滞和其诱导的细胞自噬。进一步检测mTOR信号通路的变化情况,结果表明PC-1表达可以显著增加LNCaP细胞中mTOR底物4E-BP1的表达,RNAi沉默C4-2细胞中内源性PC-1的表达则会降低4E-BP1蛋白的水平,且PC-1高表达可以拮抗mTOR抑制剂rapamycin对4E-BP1的抑制作用。利用免疫沉淀、免疫印迹、GST-pull down方法证明PC-1和4E-BP1在细胞内和体外直接发生蛋白质分子间相互作用,4E-BP1蛋白在前列腺癌细胞中可通过泛素化蛋白酶体途径降解,进一步发现PC-1通过降低4E-BP1蛋白的泛素化水平维持其稳定性;对40例前列腺癌临床标本免疫组化检测表明PC-1和4E-BP1蛋白表达在前列腺癌进程中高度相关。(3)放射治疗仍然是局部前列腺癌的主要治疗手段之一。本研究利用MTT和克隆形成实验发现,沉默PC-1基因表达增加前列腺癌C4-2细胞辐射敏感性。γH2AX Ser139磷酸化焦点检测证明,PC-1基因沉默能够降低辐射诱导DNA损伤修复能力。进一步检测发现PC-1表达受辐射诱导,可于DNA损伤后定位于DSBs位点,并且影响照后DNA-PKcs自磷酸化位点S2056的升高,提示PC-1可能通过调节DNA-PKcs活性参与DNA损伤修复过程。同时发现PC-1表达沉默细胞4Gyγ射线照射后G2/M期阻滞延长,Cyclin B1蛋白表达水平高于对照细胞,表明PC-1可能参与DNA双链断裂损伤诱发的G2/M期阻滞调节过程。(4)为了进一步探知PC-1影响的未知分子和信号通路,利用Affymetrix的基因表达谱芯片对PC-1影响的基因进行筛选。基因芯片结果mTOR信号通路相关分子如EIF4A2在LNCaP-pc-1中上调,一些翻译起始因子如EIF4G3、EIF5A2等在LNCaP-pc-1中也发生了改变,这与之前的研究PC-1激活mTOR信号通路结果一致。细胞周期相关的基因也发生了变化。其中筛选到一些细胞运动、迁移和粘附及细胞骨架基因,如JAG1,THBS1,DSC3,MAP2,TUBA3和NEDD9等。(5)通过酵母双杂交筛选发现细胞骨架蛋白FLNa和PC-1发生蛋白质分子间相互作用,免疫沉淀、免疫印迹方法证明PC-1和FLNa在体内相互作用,GST-pull down实验证明PC-1和FLNa在体外相互作用,且PC-1 N端46个氨基酸结构域和亮氨酸拉链结构负责和FLNa的相互作用。免疫荧光实验发现两者在LNCaP细胞的细胞膜褶皱共定位,而且当PC-1和FLNa共转LNCaP细胞后,运动旺盛细胞显著增加,细胞形态发生明显改变,表明PC-1和FLNa相互作用可能影响了前列腺癌细胞骨架装配,从而影响前列腺癌细胞的运动和侵袭。进一步伤口愈合实验发现PC-1沉默使C4-2细胞体外迁移能力降低。以上结果表明PC-1和FLNa相互作用可能影响前列腺癌细胞的形态、运动和迁移。(6)另外,本研究还构建了FLNa沉默的前列腺癌LNCaP和C4-2细胞株,细胞水平实验结果表明FLNa沉默促进了前列腺癌细胞的增殖、存活和恶性化程度,初步证明FLNa可能是一个新的前列腺癌抑制基因。本研究发现PC-1在前列腺癌的发生发展中参与调控多种细胞活动,包括细胞增殖、细胞黏附迁移、细胞周期以及DNA损伤修复等,鉴于这些发现,PC-1将有可能成为一个前列腺癌治疗的有效分子靶标。