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抗菌肽MytichitinA是2014年孙敬敬在厚壳贻贝的血清当中分离纯化得到的一种新型抗菌肽。MytichitinA的氨基酸残基数目为55,分子量大小为6.6kDa,分子内的6个半胱氨酸形成3对二硫键。对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有一定的抑制作用。本研究采用基因工程方法在莱茵衣藻体内对MytichitinA进行串联表达并对串联抗菌肽进行活性鉴定。本研究中采用基因工程技术将抗菌肽MytichitinA在pBluescript II SK+载体上进行三片段串联,得到重组质粒pBSK-3×MytichitinA;再将3×MytichitinA克隆到莱茵衣藻表达载体上,构建出pBSK-Ble-FH6-3×MytiA和Hsp/Rbcs-3×MytiA-Paro两套莱茵衣藻表达载体;采用电击转化法将表达载体转入野生型莱茵衣藻CC125中进行异源表达。随后通过抗性筛选和Westernblotting检测,筛选出1-7、1-23、1-90、1-99、1-130五株成功表达目的蛋白的转基因藻种;采用Amido Black定量和Westernblotting分析,检测出1-90号转基因藻种目的蛋白的表达量最高,并能稳定表达目的蛋白。采用Elisa定量分析,1-90号转基因藻种目的蛋白量占莱茵衣藻总的可溶性蛋白的0.31%;通过Ni柱对3×MytichitinA进行富集,将蛋白进行冷冻干燥后,测得目的蛋白占冻干之后的蛋白的13%,利用琼脂糖扩散法对大肠杆菌0157 (ATCC35150)和金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、单增李斯特菌(ATCC 221633)、沙门氏菌(ATCC 10467)进行抑菌活性鉴定,结果显示3×MytichitinA对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、沙门氏菌(ATCC 10467)均有抑菌活性,且3×MytichitinA对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157具有较强抑制作用。做最小抑制浓度(MIC)实验结果显示重组蛋白3×MytichitinA有广谱抗菌活性,其中对大肠杆菌0157、金黄色葡萄球菌的MIC均为60μg/mL,而对单增李斯特菌、沙门氏菌的MIC为80 μg/mL。最后通过对3×MytichitinA进行特性分析发现其能耐受不同温度和pH,对不同的酶耐受性不同,对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K稳定性差,对胰蛋白酶稳定性较好。综上所述,通过基因工程方法抗菌肽Mytichitin-A在莱茵衣藻中进行串联表达,并且具有抑菌活性,这为抗菌肽的获取提供宝贵的实践经验。