斑马鱼血小板特异性转基因系建立和表达分析以及利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除突变体

来源 :南方医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:a53825777
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
研究背景斑马鱼(Zebrafish,Danio rerio)作为重要的脊椎动物模式生物之一,近上几年内被广泛用于胚胎发育、疾病研究、药物筛选等众多领域。同时,斑马鱼在各个研究领域的应用模型也在逐步建立起来。比如白血病模型、心血管发育与疾病模型、药物筛选与安全评估模型、免疫系统模型、以及组织再生模型等。这些模型的建立为相关疾病发生机制和防治手段的研究提供了极大的便利。造血(hematopoiesis)是指血液中各种血细胞起源、增殖、分化和发育成熟的过程。成熟血细胞包括红细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞、巨核细胞和血小板。各种血细胞对机体正常生理功能的维持均具有重要作用。如红细胞能够为机体运输氧气,白细胞和淋巴细胞为机体提供免疫保护,血小板行使止血凝血功能等等。目前,人们已发现多种恶性疾病与血细胞发育缺陷密切相关。如白血病、恶性淋巴瘤、贫血、血友病等。因此,研究造血发育能够帮助人们更深入地理解这些血液相关疾病的发生过程及机理,从而为临床诊断及治疗提供指导意义。由于脊椎动物高度保守的造血系统,斑马鱼的造血发育过程与哺乳动物十分相似,都包含原始造血和定向造血两个阶段,造血发育过程也同样受到多个转录因了的调控。斑马鱼在构建血液研究模型上有其独特的优势。斑马鱼作为脊柱动物,与人类基因的同源性高达87%。斑马鱼具有体积小、繁殖快、易于养殖、生命周期短、体外受精、胚胎透明等众多独特的生物学优势。因此它不仅具有体外细胞实验的优点,同时也具有体内实验的优势。血小板是血液中的有形成分之一。血小板在止血及血栓形成、维持血管张力、宿主防御、炎症反应甚至是肿瘤生长代谢等众多生理和病理过程中起着重要作用。低等脊椎动物的血小板(thrombocyte)在功能上相当于哺乳动物的血小板(platelet)。哺乳动物的血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质,通常能在血液中存在10天左右。体积小,无细胞核,呈双面微凸的圆盘状。而斑马鱼血小板为有核细胞,胞质少而核大,胞质中有许多囊泡,囊泡开口向细胞膜,相当于哺乳动物血小板的微管系统。血小板发育是一个复杂有序的过程,多个信号通路与转录因子和细胞因子对血小板生成发育起调控作用。其中,血小板生成素(thrombopoietin,THPO,TPO)及其受体血小板生成素受体(myeloproliferative leukemia oncogene,c-MPL,MPL)对血小板的数目的维持起重要作用。作为巨核细胞和血小板生成最主要的调节因子,血小板生成素TPO的生物学效应通过其受体MPL介导,即血小板生成素受体调控血小板生成。MPL是目前发现的TPO的唯一受体。斑马鱼血小板生成素受体表达在血小板上,最早可以在受精后42 h(hours post fertilization,hpf)检测到mpl基因的mRNA的表达。Mpl属于跨膜蛋白,在血小板细胞膜上高表达。由于血小板的数量少(仅占血细胞的0.05%左右),加上相应的抗体和标记基因少,研究存在一定的闲难,故关于血小板的一些机制也未能完全清楚。相关文献报道在Tg(cd41:eGFP)转基因斑马鱼中cd41可以标记成熟血小板,但同时也有造血干细胞被标记。因此,为了方便血小板的研究,排除其他细胞干扰,建立血小板特异性标记的转基因系尤为重要。通过构建血小板特异性高表达基因的启动子和增强子的转基因品系,来研究基因的生物功能,可以为理解血小板发育的机制和发展有效的治疗手段奠定理论基础。同时,血小板特异性转基因系可作为血小板标记工具,为血小板相关研究提供极大的便利。Tol2是一种鱼源转座系统,发现于青鳉鱼(Oryzias latipes)的基因组中。利用To12转座酶系统可以将含有特异性启动子调节基因表达的序列引入鱼体内,并整合进入基因组,从而构建可稳定遗传的转基因品系。本研究就是利用To12转座子构建了含特异性启动子mpl调控增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)报告基因 eGFP 表达的序列(mpl-eGFP)载体,该质粒DNA和体外合成的相应转座酶基因mRNA共同注射到单细胞期斑马鱼胚胎中,进而建立转基因斑马鱼品系以及分析其表达。CRISPR/Cas9 系统,由 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)和 Cas9(CRISPR-associated nuclease 9)蛋白组成。CRISPR是一组成簇的规律间隔短回文重复序列,而Cas9蛋白是一种能够切割DNA的核酸酶。利用RNA引导Cas9核酸酶可以对基因组DNA进行定点修饰。CRISPR/Cas9具有设计简单、可操作性强、时间短、成本低等优势,有望成为普通生物学实验室的常用技术。CRISPR/Cas9没有物种限制,现已广泛地应用于动植物和微生物中。2013年本实验室参与“斑马鱼1号染色体基因敲除项目”,本人参与了其中12个基因的敲除筛选。利用CRISPR/Cas9技术,建立了斑马鱼基因敲除的突变体。本文研究内容总共分为两个部分:第一部分为斑马鱼血小板特异性mpl-eGFP转基因系的建立和表达分析;第二部分为利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除突变体及其筛选。第一部分:斑马鱼血小板特异性mpl-eGFP转基因系的建立和表达分析1.目的本部分的研究目的是构建mpl启动子调控eGFP表达的转基因斑马鱼,并筛选特异性标记血小板的mpl-eGFP转基因系;分析mpl-eGFP转基因斑马鱼的表达。2.方法交的表达谱和Mpl-eGFP阳性细胞免疫荧光染色的表达谱进行比较,发现在造血区域2.5 dpf的AGM区、2.5 dpf的CHT区及5 dpf的CHT区,基本上表达一致。说明我们克隆的mpl启动子能够在一定程度上代表血细胞中内源性mpl基因的时空表达。3)为了证明Tg(mpl:eGFP)转基因系特异性标记血小板,我们将其荧光标记细胞与其他血系进行比较,如Tg(coroninla:eGFP)是髓系转基因系(特异表达mpo、lyz和mfap4),Tg(gatal:DsRed)是红系转基因系(特异表达hbbe1、hbae1和alas2),Tg(cd41:eGFP)是标记HSCs和血小板的转基因系(表达gp9、kif1b、lrrc32和nfe2)。我们利用流式细胞术分选出Mpl-eGFP、Coroninla-eGFP、Gatal-DsRed以及Cd41-eGFP阳性细胞,并通过qRT-PCR检测,比较各转基因系的基因表达情况。发现血小板相关基因cd41和lrrc32在Mpl-eGFP的细胞中高表达,但是在髓系Coroninla-eGFP和红系Gatal-DsRed阳性细胞中表达量很低。同时髓系标记基因mpo、lyz和mfap4以及红系标记基因hbbe1、hbae1和alas2在Mpl-eGFP的细胞中低表达。另一方面,通过比较Mpl-eGFP和Cd41-eGFP细胞群中表达血小板相关基因gp9、kif1b、lrrc32及nfe2的表达量,我们发现这些血小板相关基因在Mpl-eGFP细胞群中表达量更高,说明mpl-eGFP比cd41-eGFP更特异地标记了血小板。4)为了进一步证明Tg(mpl:eGFP)转基因系特异性标记血小板,我们通过免疫组化抗体染色实验,发现Mpl-eGFP阳性细胞既不与髓系标记物Lcpl共染,也不与成熟红系标记物Hbael-globin共染。之前已有文献报道未成熟血小板gata1基因高表达,随着血小板成熟gata1低表达。因此,当我们将mpl-eGFP和gata1-DsRed转基因鱼一起做抗体染色,发现约80%的Mpl-eGFP阳性细胞同时也表达Gatal-DsRed。综合这些数据,表明mpl-eGFP主要标记由gata1细胞衍生的血小板,但不标记成熟红细胞或其他血系。5)为了验证Mpl-eGFP阳性细胞能够标记示踪血小板,我们通过在斑马鱼Tg(mpl:eGFP)中引入血小板减少突变mpl,观察发现相较于野生型,Mpl-eGFP阳性细胞在mpl突变体中的表达量减少,这表明Mpl-eGFP细胞V ·具有标记血小板的功能,可以用于标记示踪血小板。6)为了证明Mpl-eGFP阳性细胞是有止血功能的血小板,我们通过点损伤4 dpf的Tg(mpl:eGFP)斑马鱼,录像观察Mpl-eGFP标记的血小板对损伤的反应。我们发现损伤后血流中的Mpl-eGFP阳性细胞可以到达伤口并停留堵塞伤口,从而帮助止血。这表明mpl-eGFP标记的血小板细胞可以行使止血功能。7)为了验证被mpl-eGFP标记的细胞是否响应Tpo/Mpl通路,我们通过在Tg(mpl:eGFP)斑马鱼中过表达tpo基因mRNA,发现在血液中尾部造血区Mpl-eGFP阳性细胞的表达显著增加。mpl-eGFP标记的细胞会响应Tpo刺激,即在血小板生成的Tpo/Mpl通路上,Mpl-eGFP细胞也随之增长。8)为了验证mpl-eGFP标记的细胞是否响应非Tpo/Mpl依赖通路,我们通过在Tg(mpl:eGFP)斑马鱼中导入注射用重组人IL-11,发现Mpl-eGFP阳性的细胞的表达显著增加,说明mpl-eGFP标记的细胞会响应非Tpo/Mpl依赖通路。9)为了 了解活体斑马鱼中血小板的细胞形态特征,我们利用DIC观察到斑马鱼48 hpf尾部造血组织Mpl-eGFP细胞呈圆形或椭圆形;可以看到胞质中存在颗粒;Mpl-eGFP阳性细胞会比血管中流动的红细胞体积小。第二部分:利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除突变体1.目的本部分的研究主要是利用CRISPR/Cas9技术,靶向编辑斑马负1号染色体上的12个基因,使其产生基因敲除突变,进而从中筛选出这些基因的突变体,以用于后续进一步的研究工作。2.方法我们采用CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术,分别针对12个基因设计靶位点,合成gRNA并与cas9基因mRNA 一起显微注射进入斑马鱼单细胞时期的胚胎,对F0、F1、F2代的胚胎进行PCR、酶切和测序,从而筛选突变体传代保种。3.结果我们成功筛选了 12个基因,共得到22个突变体。这些突变体在以后将可进行详细的基因和功能方面的研究。全文结论1.我们成功构建了特异标记血小板的Tg(mpl:eGFP)转基因系,并对其表达类型进行了初步分析。这个转基因斑马鱼不仅可以更好地研究血小板的发育,而且特异标记血小板的mpl启动子还能够在mpl突变模型或者其他有关于人类遗传性血小板疾病的基因模型中表达,从而为血小板发育及其相关疾病发生机制和防治手段的研究提供了极大的便利。2.我们通过CRISPR/Cas9靶向敲除技术,成功筛选到12个基因的22种斑马鱼突变体。这表明CRISPR/Cas9敲除基因、筛选突变体是一种成熟且高效的反向遗传学筛选方法,这些突变体将在我们今后对于这些基因功能的研究中起到十分重要作用,并且有望建立起相应的疾病模型。
其他文献
随着全球化趋势的到来,商品和劳动力迅速流动,企业必须维持住自己的竞争优势,应对市场的瞬息万变。企业内的团队成了企业保持对市场快速反应的法宝,团队是企业中的小群体,成
通过对多种群尺度三种独尾草属(Eremurus)植物的花期物候及其繁殖特性、花部综合特征及其繁育系统、传粉生态学、结实空间差异等方面的研究,比较三种独尾草属植物繁育系统的
截止2018年底,我国机动车保有量已经达到3.27亿辆,连续十年成为世界机动车产销第一大国、橡胶消耗第一大国,轮胎生产量也超过了全球轮胎总生产量的一半。而轮胎在制造过程中会产生大量的挥发性有机物,且存在大风量,低浓度、成分复杂等特点,采取何种处理治理工艺能够确保达标排放方面存在困难。江苏HK轮胎企业为解决炼胶工序废气污染问题,计划增设环保处理设施对其进行处理。本文通过调研国内外挥发性有机物相关治理
随着复杂性科学的发展,复杂网络的研究逐渐受到各个学科学者的关注.为了通过网络结构来发现复杂网络的行为规律、演化方向和功能结构,学者们通过对其拓扑进行研究,发现了复杂
高校学生干部是学生中的骨干力量,对于社会、学校、学生干部自身,以及其他同学的发展都起着重要的作用,科学地挖掘、管理这一社会资源显得尤为重要。本文旨在对高校学生干部
土壤是陆生系统的重要组成部分,为我们提供赖以生存的物质基础,故土壤质量好坏与人类生活质量紧密相关。随着城市化和工业化的快速发展,城市周边土壤重金属含量也受到人为活动的强烈扰动,而且城郊是城区重要农产品产区。因此,研究城市周边土壤重金属地球化学特征和土壤环境质量对于确保土壤环境安全和人体健康具有重大的理论和现实意义。本文以北京顺义区为研究对象,通过多元统计和地统计学分析方法,系统地对顺义区表层土壤8
赵一曼是我从小就敬仰的女英雄。1905年10月25日,她出生在四川省宜宾县的一个小村庄,若是活到现在,整整110岁了。然而,为了反满抗日,为了子孙后代过上安宁幸福的生活,她在31
霸权国拥有超强的国家权力及改造国际体系的意愿,通过提供国际公共产品的方式维系国际体系的稳定,获得霸权统治的合法性。随着霸权周期的演进,霸权国维系统治的成本不断上升,
随着科学技术的不断发展,人们对高科技机械的需求量不断增加,螺杆钻具就是其中之一。螺杆钻具被广泛应用于海洋钻井平台、船舶工业、石油化工等重要领域,这些对螺杆的类型、
以《赫索格》中的现代文明下流浪者赫索格及精神探索为研究对象,探讨索尔?贝娄作品中对于现代人在文明中流浪、无家可归的精神困顿,以及走出迷惘、重建精神皈依之所的探求.