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无乳链球菌是一种人、畜、鱼共患的致病菌,在世界范围流行广泛。该菌可感染多种水产动物,引起鱼类败血症和脑膜炎,常可导致暴发性疾病的发生,具有较高的致病率及致死率,给水产养殖带来极大的经济损失。海豚链球菌是一种重要的病原菌,可在全球范围内引起鱼类侵袭性感染和暴发性疾病。荧光假单胞菌是淡水鱼类赤皮病的主要病原菌,发病范围广,可引起大多数淡水鱼类爆发赤皮病,给淡水鱼养殖业造成巨大的经济损失。这三种水生动物致病菌常会引起罗非鱼、虹鳟、鲫鱼等多种共同宿主的感染,但是仅通过其临床症状和常规诊断方法难以区分诊断。目前关于这三种菌的PCR检测方法国内外学者均有所研究,但仅局限于其中某一种或两种细菌的单重或双重PCR方法检测,关于同时检测这三种水生动物致病菌的三重PCR检测方法尚未有报道。本文分别根据GenBank中罗非鱼源无乳链球菌、海豚链球菌及荧光假单胞菌的SIP基因,LctO基因,16SPSEfluF/16SPSER的基因序列,设计三对特异性引物,经反应体系、反应条件的优化,以及特异性试验、敏感性试验及人工感染罗非鱼组织样品的检测,建立了一种可同时检测无乳链球菌,海豚链球菌及荧光假单胞菌的三重PCR检测方法。结果表明,检测无乳链球菌、海豚链球菌及荧光假单胞菌单一及混合样本时能分别扩增出SIP基因,LctO基因和16SPSEfluF/16SPSER的三条特异性条带,而维氏气单胞菌,嗜水气单胞菌,鲁氏耶尔森氏菌(Aeromonas hydrophila),豚鼠气单胞菌,鮰爱德华氏菌,不动杆菌,杀鲑气单胞菌,温和气单胞菌,嗜麦芽寡养单胞菌则无任何扩增条带；经敏感性试验,最小模板检出量为6.557×10-2ng/mL.应用：对40尾人工感染无乳链球菌,海豚链球菌及荧光假单胞菌的罗非鱼肝和肾组织中细菌DNA进行三重PCR检测和细菌分离鉴定,检出的阳性结果一致。证实所建立的方法具有快速、特异、灵敏、简便的优点,该检测方法适用于对罗非鱼等无乳链球菌,海豚链球菌,荧光假单胞菌的感染病例进行流行病学的监测。