论文部分内容阅读
(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)是降血脂药物阿托伐他汀钙的关键手性中间体,利用卤醇脱卤酶催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(D3)的脱卤氰化反应制备A7是很有潜力的合成方法。现有研究存在的主要问题是适用的卤醇脱卤酶种类少,对底物D3的催化活性很低,且鲜见有关卤醇脱卤酶分子改造提高其对D3催化活性的报道。本研究以D3为目标底物,对卤醇脱卤酶进行了筛选和分子改造,主要结果如下:(1)利用基因挖掘技术建立了 一个卤醇脱卤酶酶库,筛选获得了 一个对D3具有较高催化活力的卤醇脱卤酶HheAAM(来源于Agromyces mediolanus sp.),其全细胞催化反应酶活为13 U.L-1,比酶活为69.06 U·g-1,高于现有报道的HheC类卤醇脱卤酶HHDH和Mut-HheC2360;(2)分别利用定向进化和半理性设计方法对HheAAM进行改造:通过易错PCR方法筛选得到6个阳性突变体,均在84/88位发生突变,对84位和88位进行定点饱和突变得到另外9个阳性突变体,突变体酶活分别为Wt-HheAAM的1.32-3.46倍;根据分子对接结果对底物结合区域附近的位点进行定点饱和突变,得到4个在136/144位发生突变的阳性突变体,酶活分别为Wt-HheAAM的1.78-3.13 倍;(3)分别利用迭代饱和突变(ISM)和CASTing策略对4个关键位点(84,88,136,144位)进行组合突变:前者筛选得到14个阳性突变体,酶活分别为Wt-HheAAM的1.78-15.19倍;后者筛选得到19个阳性突变体,酶活分别为Wt-HheAAM的 1.03-11.98 倍。其中最优突变体 M4-1(84S-88L-136T-144C)的比酶活为887.80 U.g-1,是Wt-HheAAM的13倍,对D3的催化活性得到了显著的提高。同时,M4-1的最适反应pH由7.5变为8.0,最适反应温度由55℃变为60℃,50℃下的半衰期(t1/2,50℃)由 0.87h变为 2.38h。