苯乙醇苷类化合物Torenoside B和Savatiside A对阿尔茨海默症的保护作用研究

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目的:β-淀粉样蛋白引起的氧化应激在神经退行性疾病的发病机制中发挥重要作用。Aβ25–35可导致活性氧(ROS)的产生和诱导胞内钙超载。从鹿茸草中提出的单体成分savatiside A(SA)、torenoside B(TB)在心肌细胞上已被证实具有抗氧化应激活性。本实验主要探讨其在体内外对Aβ25–35引起的阿尔茨海默症(AD)的保护作用,并初步进行机制探讨,为SA和TB防治神经退行性疾病提供实验依据。方法:采用MTT比色法确定Aβ25–35诱导神经细胞的最佳造模剂量和SA、TB的有效保护剂量;倒置荧光显微镜观察神经细胞的形态变化;流式细胞仪检测神经细胞内ROS的水平;各实验组细胞内氧化指标GSH-PX、SOD、MDA的测定;DNA ladder检测细胞DNA损伤;流式细胞仪测定神经细胞内钙离子浓度;Western Blot法检测Calnexin、P-AMPK1、P-AMPK2以及COX-2蛋白的表达;在体内,采用单侧海马注射Aβ25–35诱导小鼠AD模型,探讨SA和TB的神经保护作用。结果:Aβ25–35诱导PC12和SH-SY5Y神经细胞凋亡,SA和TB两个化合物均能提高细胞存活率;倒置显微镜下可观察到细胞形态发生明显改变,在Aβ25–35组,PC12和SH-SY5Y细胞生长明显受到抑制,细胞集聚、贴壁功能减弱,部分细胞碎裂、死亡,给予SA、TB后,均能有效对抗Aβ25–35引起的细胞形态变化;Aβ25–35可引起SH-SY5Y、PC12细胞内ROS水平显著升高,SA,TB(25-100uM)均可抑制Aβ25–35引起的细胞内ROS水平的升高,当同时给予活性氧抑制剂NAC处理后,细胞内ROS水平会进一步降低,表明SA,TB(25-100uM)发挥着抗氧化应激的作用;损伤组细胞内的MDA含量均较之正常组细胞有所升高,SOD和GSH-PX活性降低,而给予受试药物处理后各实验组胞内MDA含量降低,SOD和GSH-PX活性有所提高,进一步表明SA、TB发挥着抗氧化作用;DNA ladder检测结果表明Aβ25–35处理细胞24h后,核小体间DNA断裂,形成质量不同的片段,DNA出现梯形条带,而SA、TB(100μM)处理后能明显减弱Aβ25–35引起的DNA梯形条带;流式细胞仪检测显示Aβ25–35(30uM)可引起SH-SY5Y、PC12细胞内钙离子浓度显著升高;而SA、TB(50-100uM)可抑制细胞内Ca2+浓度的升高;Western blotting结果表明,Aβ25–35显著增强PC12、SH-SY5Y细胞内钙调蛋白Calnexin的表达,增强腺苷酸活化蛋白激酶P-AMPK1的表达,但不影响P-AMPK2的表达,同时显著增强小鼠海马组织中蛋白COX-2的表达。SA(50-100uM)可降低钙调蛋白Calnexin和腺苷酸活化蛋白激酶P-AMPK1的活化,进而抑制PC12、SH-SY5Y细胞的氧化应激;在水迷宫实验中,Aβ25–35(10.3ug)组小鼠逃避潜伏期明显延长,穿越次数明显减少,SA和TB(50-100mg/kg)可显著降低小鼠的逃避潜伏期,增加小鼠的平台穿越次数;同时,在Y迷宫实验中也得到了相似结果,Aβ25–35组小鼠错误次数明显增多,SA和TB(50-100mg/kg)可显著降低小鼠的错误次数;HE和尼氏染色结果表明,SA和TB可改善海马CA1区的神经椎体细胞的结构损伤;电镜检测结果表明,SA和TB可减弱海马CA1区的神经元以及突触的损伤。小鼠海马组织蛋白检测表明,单体化合物SA能够显著减少由Aβ25–35诱导引起的小鼠海马组织中蛋白COX-2的异常高表达。结论:SA、TB可改善Aβ25–35引起的AD,其机制可能是通过抗氧化机制,调节细胞内钙平衡,降低钙调蛋白Calnexin和腺苷酸活化蛋白激酶家族中P-AMPK1表达,以及抑制受损神经组织中COX-2的活化而起作用。
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