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免疫抑制性受体传递免疫抑制和免疫耐受信号,是获得性免疫调节的重要分子,包括程序性死亡因子1 (programmed death-1, PD-1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)和淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3, LAG-3)等。多种慢性或持续性病毒感染过程中,PD-1、CTLA-4或LAG-3等过量表达,活化免疫负调节信号通路,引起免疫细胞凋亡、增殖能力降低以及抗病毒细胞因子分泌减少等,造成机体免疫功能损伤或免疫抑制,阻断PD-1、CTLA-4、LAG-3与其相应配体相互作用,可以逆转T细胞免疫功能。猪瘟(classical swine fever, CSF)和断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)是猪的两种重要传染性疾病,目前对CSF和PMWS引起免疫功能损伤或免疫抑制的致病机制已经从病原和宿主两方面进行了深入广泛的研究,但是,在宿主效应细胞免疫调节方面研究较少,免疫抑制性受体是否参与CSF和PMWS的免疫致病机制尚未见报道。因此,本课题旨在研究CSF和PMWS感染过程中免疫抑制性受体的转录水平及其对免疫效应影响,筛选和鉴定能阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽基序,以期进一步揭示CSF和PMWS的免疫致病机制,为研究免疫调节药物和佐剂提供理论基础。PD-1/PD-Ls通路活化是多种病毒性疾病造成免疫损伤的重要致病机制。本部分主要研究CSFV感染猪后PD-1及其配体PD-L1和PD-L2的转录水平变化。45日龄CSFV抗体阴性仔猪感染CSFV石门株,分成两组：感染组(10头)和对照组(5头),颈部肌肉注射105×TCTD50的CSFV/头,对照组注射0.5 mL的PBS,感染后0 d、3 d、7 d、10 d、14 d和21 d,颈静脉采集抗凝血5 mL,分离猪外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs),实时荧光定量PCR (quantitative real-time, qPCR)检测PBMCs中PD-1、PD-L1、PD-L2、IL-2、IL-10的转录水平,同时检测血浆中CSFV载量,用CFSE标记PBMCs, rswIL-2和CD3单抗刺激,测定T细胞的增殖能力。结果显示,在感染后第3 d PD-1和PD-L1转录水平开始升高(p<0.05),第7 d达到峰值(p<0.01),而PD-L2转录水平在感染后3 d达到峰值(p<0.01),之后开始降低。血浆中CSFV载量在感染后第7 d达到峰值,PD-1及其配体转录水平与CSFV载量成正相关。免疫负调节细胞因子IL-10转录水平在感染后7d显著升高(p<0.01),IL-2转录水平在PD-1及其配体转录水平下降之后即感染后14 d显著升高(p<0.05),感染后第7 d,T细胞增殖能力降低。结果表明CSFV感染能够引起PD-1/PD-Ls通路改变。选取河南新乡地区某规模化养猪场疑似患PMWS的断奶仔猪9头,临床症状表现为渐进性消瘦或生长缓慢、厌食、精神沉郁、皮肤苍白、被毛蓬乱、咳嗽和呼吸困难等,健康对照组6头,PCR检测血浆、肺脏和脾脏中病原PCV2、PRRSV、PPV、PRV和CSFV,采集猪抗凝血5mL/头,采集抗凝血2次,间隔7d,分离PBMCs, qPCR检测PBMCs中PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、PTEN以及细胞因子IL-2、IL-10和IFN-y的转录水平,流式细胞术检测PBMCs的增殖能力。结果显示,发病猪的血浆、肺脏和脾脏中分别扩增出PCV2 381 bp特异性目的条带,未扩增出PRV、PPV、PRRSV和CSFV的特异性目条带,根据临床症状和病原检测,确诊发病猪患PMWS。PD-L1(p<0.01)和PD-L2(p<0.05)转录水平显著升高,而PD-1、CTLA-4和LAG-3的mRNA水平无显著变化,PTEN的mRNA水平显著升高(p<0.01),PTEN表达量升高证实PD-1/PD-Ls通路的活化,而且PD-L1还可以与B7分子结合抑制B7与CD28分子的结合,阻断共刺激信号B7/CD28通路,抑制T细胞活化；IL-10转录水平显著升高(p<0.01),IL-2和IFN-y轻微升高,但是统计学分析不显著,PBMCs增殖能力显著降低。结果表明自然感染PMWS过程中可以引起PD-/PD-Ls通路改变,抗病毒细胞免疫功能降低,进一步揭示PMWS的免疫致病机制。根据PD-1与其配体复合物的三维结构与结合位点,设计合成包含PD-1与PD-L1结合位点的系列多肽,初步探讨合成多肽阻断PD-1/PD-L1通路的免疫调节。分离患PMWS猪的PBMCs, CFSE标记细胞,多肽与ConA共同刺激培养3 d,流式细胞术检测PBMCs的增殖变化；选取能促进PBMCs增殖的多肽标记FITC,检测标记多肽与猪重组蛋白PD-L1及PBMCs的结合情况；选取能结合猪PD-L1蛋白的多肽与灭活CSFV共同免疫小鼠后,检测血清中CSFV的抗体水平。结果显示,多肽PD-15能显著提高猪PBMCs增殖能力。并且PD-15能有效结合重组蛋白PD-L1和PBMCs,多肽PD-15与灭活CSFV共同免疫小鼠后,CSFV抗体水平显著升高。结果表明多肽PD-15能阻断猪PD-1/PD-L1通路,促进PBMCs增殖和提高抗体水平,为研制新型免疫调节佐剂奠定基础。