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高等植物的开花过程是植物由营养生长向生殖生长转换的最重要的过程,决定了植物生殖发育的时期和质量,对于植物的生殖发育具有重要的意义,研究植物开花时间调控的分子机制对于调节植物繁殖和发育、提高作物产量和品质具有重大的意义。实验室前期研究从拟南芥T-DNA插入突变体库中筛选获得了一株早花突变体efs1(earlyflowering in short mutant 1),通过Genome Walking技术和生物信息学方法鉴定出一个新的拟南芥开花调控相关基因EFS1,为进一步明确该基因的功能及其在开花调控途径中的具体作用,本研究通过互补回复和超表达试验,验证了EFS1基因确为拟南芥开花调控基因;利用RT-PCR和GUS组织化学染色技术,明确了EFS1基因在不同组织中表达水平及组织定位;利用RT-PCR和Real-Time PCR技术,初步明确了EFS1基因在开花控制途径中的位置及其调控开花的模式,为进一步阐明EFS1基因的调控机理奠定良好基础。
1.将已经构建的EFS1基因的表达载体pCAMBIA1300-EFS1(含启动子)-NOS经农杆菌介导转化efs1突变体和Col-0野生型,获得了回复和超表达转基因株系;经PCR和Southern blotting鉴定,确定了EFS1基因以多拷贝形式成功整合到efs1突变体基因组中;
经RT-PCR分析,确定了转基因系中EFS1基因的表达高于野生型;表型分析发现,回复转基因系的开花时间与野生型相似,恢复到了野生型表型,且开花时间与EFS1的表达量呈正相关,表明了转基因植物的恢复表型确实是由于外源EFS1的表达造成的。
2.利用RT-PCR技术,鉴定了EFS1在莲座叶、茎、茎叶和花中均有表达,尤其在莲座叶和花中表达较高;构建了双元载体pCAMBIA1300-ProEFS 1∷GUS-NOS分别转化烟草和拟南芥Col-0进行组织定位,经GUS染色发现EFS1在成熟植株的莲座叶、茎、茎叶、花及一周龄幼苗的地上部和根中均有表达,且在花中表达最多,与RT-PCR分析结果一致。
3.利用RT-PCR和Real-Time PCR 技术,检测了EFS1基因突变对开花调控中重要基因(SPY、FLC、GI、CO、FT和LFY)的作用,发现EFS1基因突变(表达量降低)
后,SPY、FLC、GI、CO和FT的表达水平下降,由此可初步推断,该基因对开花起抑制作用。
4.根据开花调控相关基因的RT-PCR和Real-Time PCR 检测的结果,我们初步明确了EFS1的基因调控开花的模式。EFS1基因的低表达量降低了赤霉素途径中的负调控因子SPY的表达,促进内源GA的传递,同时,春化途径中负调控因子FLC的表达以及光周期途径GI、CO和FT的表达也降低,从而促进植株早花。