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microRNA(miRNA)是当今生物学领域比较受关注的小RNA之一,包含18-24个核苷酸,通过结合靶标mRNA的3’UTRs转录后调节靶向基因表达。它在肿瘤细胞迁移和上皮间充质转化(EMT)的发生过程中起重要作用,而且在嗅觉神经发育中也扮演着重要的角色。ATF5(Activating transcription factor 5),即转录激活因子5,属于转录因子ATF/CREB的成员之一。它在神经系统的分化和细胞凋亡中都起到关键的作用。利用生物信息学分析,可以看到,转录因子ATF5的3’非翻译区存在miR-200a结合位点,但它是否是miR-200a的一个直接靶标还未知。AC3(腺苷酸环化酶3)基因在小鼠的神经发育过程中起着重要的作用,ATF5作为它的一个上游的转录因子对它起调控作用。但是详细的分子机制还未揭晓。TET是ten-eleven translocation的缩略形式,是生物体的一种双加氧酶。能氧化5-甲基胞嘧啶(5-mC)转变为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC),是DNA去甲基化中的一种重要的酶,那么它对miR-200家族的启动子区是否起到去甲基化作用还有待研究。本论文以Hela细胞,3T3-L1细胞,CT26.WT细胞和293T细胞为实验材料,从以下三个部分进行研究:1、构建含有野生型ATF5基因3’UTR全长的荧光素酶报告基因质粒及种子序列(与miR-200a结合)突变型的ATF5基因3’UTR的荧光素酶报告基因质粒,将miR-200a mimic与其中一种质粒一起转染至Hela细胞中,一定时间后,采用报告基因检测系统检测,结果显示,miR-200a mimic显著抑制了野生型质粒中荧光素酶的表达,而对突变质粒的影响不大,说明miR-200a结合于ATF5的3’UTR。随后检测了miR-200a mimic/inhibitor转染3T3-L1细胞和CT26.WT细胞后ATF5基因的mRNA和蛋白的表达情况,结果显示,转染miR-200a mimic后使ATF5基因表达沉默,而转染miR-200a inhibitor后ATF5的表达升高,进一步说明miR-200a调控ATF5的表达。2、将ATF5 cDNA克隆至真核表达载体中,命名为ATF5,以空载体为对照,命名为NC,该真核表达载体具有neo抗药基因,转染3T3细胞后加适宜浓度的G418进行药筛,然后检测ATF5与AC3基因的mRNA和蛋白的表达情况。通过CHIP以及荧光素报告系统检测ATF5与AC3的相互作用情况,可以看到,转染后与对照组相比ATF5和AC3基因在mRNA水平和蛋白水平的表达都上调,并且ATF5在AC3的启动子区大约400-1200bp的位置结合发生作用。3、以3T3细胞为实验材料,用合成的Tet3-siRNA进行转染,沉默TET3的表达,然后检测miR-200a启动子区的甲基化与非甲基化程度,结果表明,沉默TET3后,miR-200a启动子区的甲基化水平升高,非甲基化水平降低。结论:1、ATF5基因是miR-200a的靶标之一。2、ATF5基因表达的上调促进AC3基因的表达。3、TET3基因的敲低引起miR-200a启动子区甲基化水平升高,去甲基化水平降低。