第一部分 有氧运动对心肌梗死大鼠外周血及心脏BDNF/TrkB通路的影响及其心脏保护效应目的研究有氧运动对心肌梗死后大鼠外周血及心脏组织脑源性神经营养因子(BDNF)水平的影响,同时探查BDNF的高亲和力受体-酪氨酸激酶受体B(TrkB)在运动后的表型及磷酸化水平的改变,明确BDNF/TrkB和运动诱导的心脏血管生成及心功能改善的关系,探讨BDNF/TrkB通路在运动介导的心肌梗死后心脏保护中的作用。方法1、动物分组90只雄性SD大鼠(12周龄,220-250 g/每只)随机分为6组:假手术组(Sham)、心肌梗死组(MIC)、心肌梗死+运动组(MIE)、心肌梗死+运动+一氧化氮(NO)抑制组(MIE+L)、心肌梗死+运动+TrkB阻断组(MIEK)、心肌梗死+运动+二甲基亚砜(DMSO)组(MIED)。NO抑制组大鼠采用100 μg/ml浓度的NO合成酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯基(L-NAME)溶于饮用水中,保证每日25 mg/kg的摄入量;TrkB阻断组大鼠腹腔注射K252a(一种TrkB阻断剂),K252a溶于25%DMSO,终浓度10 μg/ml,从第七周开始注射至运动周期结束,每日剂量100 μg/kg。MIED组大鼠注射等剂量的DMSO。2、缺血模型的制备使用戊巴比妥钠(0.2 ml/110g)腹腔注射麻醉,建立呼吸支持,行冠状动脉左前降支结扎术,结扎成功后,左心室前壁会变苍白并且运动异常,逐层关胸。假手术组只开胸穿线,不结扎冠状动脉,手术时间与其他组匹配。3、运动方案实施采用跑台的方式进行有氧运动训练。心肌梗死手术后一周开始跑台训练,训练时长从10 min/d开始,逐日增加,至第五天达到60min/d并长期维持至训练结束。训练速度从5m/min开始,逐渐增加到20 m/min并长期维持至训练结束。跑台坡度从0度开始,逐渐增加到25度并长期维持至训练结束。每周训练五天、休息两天,共训练8周。4、心脏超声分析以及心脏/身体重量比值测量心肌梗死手术后一周、运动方案实施前以及最后一次运动训练完成后48小时,每组分别取8只大鼠,异氟烷吸入麻醉下进行经胸超声心动图检测,用来评估心功能。选取频率为12 MHz的超声探头进行心脏大小和功能参数的采集,用高分辨率超声Vevo770系统进行数据分析。探头放置于大鼠左前胸,在心脏乳头肌水平进行M型超声检测,测量舒张末期左心室内径(LVIDd)、收缩末期左室内径(LVIDs)。系统自动算出射血分数(EF)、短轴缩短率(LVFS)所有检测指标均取3个心动周期的平均值为结果,超声测量依据美国超声心动图学会制定的标准。5、标本提取及检测心肌梗死手术后一周即运动方案实施前以及最后一次运动训练完成后分别经内眦静脉、尾静脉和腹腔静脉采集各组大鼠外周血,ELISA检测BDNF、NO水平。最后一次运动结束3小时后,提取梗死心脏周边区的组织进行免疫组织化学检测BDNF及TrkB蛋白定位及染色强度。使用CD34作为血管内皮标志物,检测围梗死区毛细血管密度。提取梗死心脏周边区的蛋白组织进行Western-blot检测BDNF、TrkB-FL、TrkB-T表达水平及两种TrkB磷酸化程度。结果1、免疫组织化学染色BDNF及其受体TrkB在心肌细胞及间质血管中均有表达。与Sham组比较,MIC及MIE+L组BDNF表达显著降低,MIE组BDNF表达较MIC组显著增高。MIC、MIE及MIE+L组TrkB表达水平显著高于Sham组,三组间的表达水平无明显差异。2、血管密度检测MIC组毛细血管密度低于Sham组,毛细血管密度在MIE组、MIEK组、MIED组均较MIC组增高。MIEK组的毛细血管密度较其他两个运动组降低。3、Western-blot检测与Sham组比较,MIC及MIE+L组BDNF蛋白水平显著降低,MIE、MIED和MIEK组BDNF蛋白水平较MIC及MIE+L组显著增高。MIE、MIED和MIEEK组TrkB-FL蛋白水平较MIC组显著增高,而所有心肌缺血组TrkB-T蛋白水平较Sham组均显著升高。与Sham组比较,MIC及MIEK组TrkB-FL蛋白磷酸化水平下降,MIC组TrkB-T蛋白磷酸化水平较Sham组下降。MIE及MIED组TrkB-FL和TrkB-T蛋白磷酸化水平较MIC、MIE+L和MIEK组显著增高。MIE和MIED组Akt磷酸化水平较Sham和MIC组显著增高,MIE+L和MIEK组Akt磷酸化水平较MIE和MIED组降低。4、心脏超声检查与Sham组比较,各心肌缺血组EF、LVFS均下降,LVID-d、LVID-s均有增高;与MIC组比较,EF、LVFS在MIE组、MIEK组、MIED组均增高,LVID-s显著降低;MIE组、MIED组LVID-d较MIC组降低,但MIEK组LVID-d与MIC组无显著差异。与MIE和MIED组比较,MIEK组EF、LVFS均下降,而LVID-d、LVID-s均有增高。5、ELISA检测运动方案实施前,Sham、MIC、MIE组大鼠血清BDNF水平无显著差异,MIC、MIE组NO 水平较Sham组增高;运动方案结束后,MIC组大鼠血清BDNF水平较Sham组降低,而MIE组BDNF水平较MIC组显著增高,MIC组NO水平依然高于Sham组,但较MIE组显著降低。大鼠血清BDNF 水平与心肌毛细血管密度、心脏EF值呈正相关;各组大鼠血清BDNF前后变化幅度与其EF值变化幅度呈正相关。结论运动提高心肌梗死后大鼠外周血及心肌BDNF蛋白水平并激活其高亲和受体TrkB及其下游Akt通路,其中eNOS/NO发挥重要调节作用。运动提高心肌梗死后大鼠血清BDNF 水平并且与心肌血管生成和心功能改善密切相关。阻断体内BDNF/TrkB通路,可抑制运动诱导的心肌梗死后心肌血管生成及心功能改善,提示BDNF/TrkB通路在运动的心脏保护效应中发挥重要介导作用。第二部分 运动激活BDNF/TrkB通路的机制研究目的用12 dyn/cm2流体剪切力模拟运动对血管壁的生理效应,研究剪切力对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中BDNF及其高亲和力受体TrkB蛋白表达的影响,明确剪切力作用下两种表型TrkB磷酸化情况,明确其与剪切力诱导的细胞迁移及小管形成的关系,探讨eNOS/NO在剪切力调节BDNF/TrkB通路激活中的作用。方法1、体外流体剪切力干预:体外培养的2-5代HUVECs用于实验。将HUVECs接种至培养载玻片上,经完全培养基培养24小时后,利用体外流室装置系统给予0、1、3、6、12小时的脉冲剪切力(12dyn/cm2)刺激,分别给予L-NAME(10-4mol/L)、TrkB-Fc(1(μg/mL)干预。2、静止培养的 HUVECs 给予 SNAP(10-6 mol/L)干预 0、1、3、6、12 小时。3、Westem-blot检测0、1、3、6、12小时5个时间点HUVECs 中BDNF、TrkB-FL、TrkB-T蛋白表达情况及两种TrkB受体磷酸化水平。4、ELISA检测循环流体中BDNF水平。5、RT-PCR检测循环和非循环流体干预下的0、1、3、6、12小时5个时间点HUVECs中BDNF、TrkB-FL mRNA表达情况。6、分别给予L-NAME(10-4mol/L)、TrkB-Fc(1 μg/mL)、PKGI(I μmol/L)、TEMPO(I0100μmol/L)与剪切力共同干预HUVECs 3小时,进行迁移试验、小管成型试验,观察细胞功能状态及BDNF/TrkB阻断对其影响。结果1、流体脉冲剪切力(12 dyn/cm2)可促进HUVECs表达及分泌BDNF,1小时可见升高,至3小时达峰值后逐渐下降,但至12小时仍高于静止状态的水平。流室装.置系统中的循环细胞液BDNF水平从1小时至12小时持续增高。2、流体脉冲剪切力(12 dyn/cm2)可促进HUVECs表达TrkB-FL,1小时可见升高,至3小时达峰值后逐渐下降,至12小时恢复至静止状态的水平;流体脉冲剪切力可促进TrkB-FL磷酸化水平,1小时可见升高,至3小时达峰值后逐渐下降,但至12小时仍显著高于静止状态的水平。3、流体脉冲剪切力(12dyn/cm2)对TrkB-T蛋白表达及磷酸化水平无显著影响。4、流体脉冲剪切力和L-NAME共同干预HUVECs,与静止状态的细胞比较,其BDNF及TrkB-FL蛋白表达水平在各个时间点均无显著变化,TrkB-FL磷酸化水平亦无显著改变。PKGI显著抑制剪切力导致的BDNF表达上调,TEMPO抑制剪切力诱导的TrkB-FL磷酸化。SNAP干预静止状态下的HUVECs,其BDNF表达显著增高,但1小时后逐渐降低,至3小时已恢复至基础水平,而TrkB磷酸化水平在相应时间点无显著变化。5、用循环流体干预的HUVECs中BDNFmRNA和TrkB-FLmRNA表达随剪切力施加时间持续上升;用非循环流体干预的HUVECs中BDNFmRNA表达随剪切力施加时间持续上升,而TrkB-FLmRNA表达随剪切力施加时间进行性下降。6、流体剪切力干预3小时后,HUVECs的迁移及小管成形能力较静止状态HUVECs显著增强,而TrkB-Fc和剪切力共同干预的HUVECs的迁移及小管成形能力较单纯剪切力干预细胞减弱,但仍强于静止状态的细胞;L-NAME和剪切力共同干预的HUVECs的迁移及小管成形能力较静止状态HUVECs显著下降。结论流体剪切力可促进HUVECs表达和分泌BDNF,剪切力作用下的TrkB-FL蛋白表达及持续激活与循环流体中BDNF水平密切相关,eNOS/NO在此过程中发挥重要调节作用,通过PKG途径促进BDNF合成,通过亚硝基反应参与TrkB-FL磷酸化;阻断BDNF/TrkB通路,可大部分抑制剪切力诱导的细胞迁移及小管形成,在动物实验基础上进一步证实了内皮细胞是运动时血清BDNF的重要来源,BDNF/TrkB-FL通路在运动促血管生成效应中发挥重要介导作用。