猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的新发病毒性传染病。自1987年首次在美国报道以来,PRRS已遍及世界各主要养猪国家与地区,并成为危害养猪业最严重的传染病之一,给各国养猪业造成了巨大的经济损失。　　 PRRSV感染后,仅能诱导低水平、迟缓的中和抗体,而且病毒在机体内持续感染导致病毒血症的长期存在。人们推测微弱的天然免疫反应是导致这些现象的根本原因,但其具体分子机制不清楚。为了揭示PRRSV逃避天然免疫的机制,本文对PRRSV感染细胞后的天然免疫反应信号通路进行了研究。具体内容如下:　　 1.PRRSV感染抑制IFN-β产生分子机制的研究　　 采用IFN-β荧光素酶报道系统检测发现PRRSV感染MARC-145细胞后不能诱导IFN-β的产生,半定量RT-PCR检测也获得了相似的结果,而且PRRSV感染能显著抑制转染双链RNA(poly(IC))诱导激活的IFN-β产生,提示PRRSV可能通过干扰IFN-β产生的策略进行免疫逃避。进一步检测了PRRSV感染后NF-kB、AP-1和IRF3的激活情况以及IRF3转定位,发现PRRSV感染细胞后能激活NF-kB和AP-1,但抑制IRF3的核转位和激活。随后,针对干扰素信号途径TLR和RIG-Ⅰ进行了深入分析,发现PRRSV感染细胞后能降低TLR3接头蛋白TRIF超表达诱导的IFN-β产生,表明PRRSV可通过干扰TLR3途径抑制干扰素的产生。另外,在对RIG-Ⅰ信号途径的分析中,通过IRF3、TBK1、IKKε、IPS-1、RIG-Ⅰ的超表达分析,发现PRRSV感染不干扰TBK1和IKKε下游通路的完整性,但损害IPS-1和RIG-Ⅰ的功能,而且此途径对IFN-β产生的抑制作用明显强于TLR3途径,表明PRRSV可通过干扰TLR3和RIG-Ⅰ两种信号通路抑制IFN-β的产生,但主要依赖于干扰RIG—Ⅰ途径。　　 2.PRRSV感染激活NT-κB的分子机制的研究　　 PRRSV感染后抑制IFN-β的产生,但能显著激活NF-κB。NF-κB是一类具有多重转录调节作用的核蛋白因子,不仅在天然免疫反应、获得性免疫反应和细胞的增殖中都有着重要的作用,而且与病毒感染后的炎症反应密切相关。为了阐明PRRSV感染激活NF-κB的信号通路,分别研究了RIG-Ⅰ和TLR信号通路在PRRSV激活NF-kB的作用。结果显示PRRSV可通过TLR信号通路中的接头分子TRIF、MyD88和TRAF6激活NF-κB,而与RIG-Ⅰ信号通路及TRAF2无关。为了进一步挖掘参与NF-κB激活的PRRSV自身编码蛋白,通过NF-κB DNA结合试验和NF-κB荧光素酶报告系统对PRRSV编码的所有结构蛋白和非结构蛋白进行筛选,发现结构蛋白N蛋白和非结构蛋白Nsp2能够显著诱导NF-κB的激活。考虑到N蛋白在PRRSV中的高度保守性,进一步构建了N蛋白不同区域缺失的11种突变体,通过NF-κB荧光素酶报道系统分析,发现N蛋白的30-73位氨基酸是激活NF-κB必需的,而该区域正好位于N蛋白的RNA结合域和核定位区域,提示N蛋白的RNA结合域和核定位区域可能在激活NF-κB以及随后的亲炎症因子的产生中具有重要作用。　　 3.PRRSV感染抑制IFN-λ1产生分子机制的研究　　 IFN-λ是最近才发现的一类新的Ⅲ型干扰素。为了探讨PRRSV感染后IFN-λ的表达及其可能的作用机制,通过荧光定量RT-PCR分析了PRRSV感染细胞后不同时间IFN-λ1 mRNA的表达,发现PRRSV感染不能诱导IFN-λ1的产生,提示抑制IFN-λ的产生是PRRSV的另一种有效的免疫逃避策略。通过IFN-λ1启动子顺式作用元件的分析,发现PRRSV感染抑制dsRNA诱导的IFN-λ1的产生主要通过抑制转录因子IRF的活性。进一步通过IFN-λ1启动子荧光素酶报道系统并结合参与干扰素诱导的各种信号分子,发现PRRSV感染不干扰IRF3、TBK1和IKKε下游通路的完整性,但干扰RIG-Ⅰ的接头分子IPS-1的活性,从而抑制RIG-Ⅰ诱导的IFN-λ1的产生。与PRRSV感染抑制IFN-β产生的信号通路不同的是,PRRSV感染对TLR3的接头分子TRIF诱导的IFN-λ1的产生却没有明显的影响,提示PRRSV感染主要通过干扰RIG-Ⅰ信号通路抑制IFN-λ1的产生。　　 4.不同类型干扰素抑制PRRSV增殖的比较研究　　 PRRSV对干扰素的高度敏感性提示干扰素可以作为抗PRRSV感染的一种潜在的治疗性制剂。迄今为止,已有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干扰素被发现。为了比较不同类型干扰素抗PRRSV的效果和可能的作用机制,分别测定了IFN-α2、IFN—β、IFN-γ、IFN-λ1(IL-29)和IFN-λ2(IL-28a)对PRRSV增殖的影响。结果表明,所有的干扰素对PRRSV的增殖都有抑制效果且呈剂量依赖性,但是Ⅰ型和Ⅲ型干扰素抑制PRRSV的增殖的效果明显强于Ⅱ型干扰素。任何两种干扰素的联合作用都没有显著地提高它们的抗PRRSV效果。此外,IFN-α2、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1(IL-29)和IFN-λ2(IL-28a)处理MARC-145细胞都能诱导干扰素刺激基因2’5’-OAS、ISG56和MxA的表达,但其诱导的能力有差异,Ⅰ型和Ⅲ型干扰素诱导这些干扰素刺激因子(ISG)的能力要显著强于Ⅱ型干扰素,表明在MARC-145细胞中,Ⅰ型和Ⅲ型干扰素抑制PRRSV增殖的效果比Ⅱ型干扰素好。