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第一部分不同部位的子宫内膜异位症疼痛大鼠模型的脑功能活动分析
目的:子宫内膜异位症(Endometriosis，EM，以下简称内异症)是育龄期女性常见的妇科疾病。疼痛、不孕和盆腔包块是其主要的临床表现和体征，约80％的内异症患者遭受不同程度的疼痛，其疼痛的原因主要是中枢敏化。本研究通过不同部位的内异症大鼠模型进行了高位中枢的脑功能活动分析，探索中枢敏化机制在不同部位子宫内膜异位模型间的差异。
方法:20只Sprague-Dawley雌性大鼠进行不同部位的内异症造模，分别为腹腔5只，腓肠肌组5只，卵巢组5只，假手术对照组5只。行为学评估不同部位内异症大鼠模型的疼痛敏化情况，随后对所有大鼠进行脑部功能核磁检测，局部一致性(regional homogeneity，ReHo)方法分析大脑中枢功能活跃区域的相关脑功能活动信号，找到异常功能激活区域。尼氏染色观察异常激活区域神经细胞的形态变化。
结果:通过行为学疼痛测试评估，发现腹腔EM组、腓肠肌EM组的疼痛敏感性高于卵巢EM组和对照组，卵巢EM组和对照组疼痛敏感性无差异。功能核磁检测分析得出在右侧丘脑及左侧嗅结节腓肠肌EM组的ReHo值低于其它三组。在右侧丘脑，腓肠肌EM组的尼氏小体染色加深，神经元数量较其他三组减少。在左侧嗅结节，四组的神经细胞数量及形态变化无差异(P＞0.05)。
结论:丘脑可能是不同部位内异症相关性疼痛中枢敏化机制的重要激活脑区。腓肠肌EM组的大鼠模型在丘脑区激活信号减弱，疼痛敏化增强。此发现可能为后续的不同部位内异症疼痛的影像学和病理学研究提供实验数据参考。
第二部分子宫内膜异位症疼痛大鼠模型异常激活脑区的分子机制探讨
目的:子宫内膜异位症是育龄期妇女常见病，70-80％的患者有不同类型的疼痛。目前与该疾病相关性疼痛的机制尚不清楚，中枢敏化可能是导致长期疼痛或疼痛反复的原因，但大多数关于子宫内膜异位症疼痛的研究目前都停留于行为或形态的观察，并没有提供足够的分子机制证据。因此本研究的目的是进一步了解大脑中枢敏化反应异常区域的变化，探索子宫内膜异位相关性疼痛中枢敏化的分子机制，从源头上解决问题，同时为临床治疗提供可靠的实验依据。
方法:40只Sprague-Dawley雌性大鼠进行子宫内膜异位症造模，行为学评估疼痛模型筛选出28只疼痛大鼠作为实验组，20只Sprague-Dawley大鼠行假手术为对照组，对所有大鼠进行全脑功能磁共振扫描，ReHo分析方法找到与中枢敏化有关的异常激活脑区，尼氏染色观察目标脑区的神经细胞状态，mRNA测序探索目标脑区差异基因的表达情况，实时定量PCR验证显著相关的差异基因表达，生物信息学方法分析与子宫内膜异位症疼痛中枢敏化发生机制的相关蛋白功能及蛋白通路，免疫组化染色观察关键蛋白TRPV1、NMDRA在该脑区的表达情况。
结果:行为学疼痛测试评估，疼痛组大鼠的疼痛阈值明显低于对照组，P＜0.001。fMRI扫描全脑，疼痛组的左侧前扣带皮层2区(Cg2)、左右侧丘脑(Tha)、海马CA1区、右侧脑干(BS)的ReHo信号较对照组明显增强，P＜0.005。尼氏染色发现ReHo信号增强的脑区如前扣带皮层、丘脑及海马，其尼氏小体染色加深，形态异常，周围可见凋亡的神经元;神经细胞核浓缩变形，核浆染色加深，凋亡细胞周围的神经元体积与对照组相比代偿性增大。mRNA测序结果发现三个目标脑区分别有139、101和66个基因异常表达，最显著的异常表达基因大都参与氧化还原反应所需的蛋白合成过程。GO和KEGG分析发现异常调节的差异基因主要参与了钙信号通路、轴突导向、局灶黏附和PI3K-Akt信号通路过程，通过免疫组化检测，其中的关键蛋白TRPV1和NMDAR在目标脑区表达呈强阳性。
结论:子宫内膜异位症疼痛中枢敏化的关键脑区可能发生在前扣带皮质、海马和丘脑。相关脑区的血氧平衡主要通过神经细胞和突触的可塑性参与调节。其分子机制可能涉及差异表达基因调控相应蛋白参与的PI3K/Akt信号通路、钙离子介导的瞬时受体电位通道蛋白通路和局灶黏附激酶等通路介导的突触可塑性调节机制。
第三部分通过tDCS降低内异症疼痛大鼠炎症小体NLRP3的激活缓解中枢敏化性疼痛
目的:疼痛、月经异常和不孕仍是子宫内膜异位症的主要症状。而疼痛症状在青春期和成年女性患者中高达70％-80％。疼痛的发生机制尚不清楚，可能与异位病灶种植后机体在局部产生炎症和疼痛介质，导致局部相关神经功能障碍，进而引起中枢敏化有关。雌孕激素受体表达的平衡受子宫内膜异位症局部炎症介导的炎症小体通路调节。NLRP3炎症小体在子宫内膜异位症疼痛的发生发展中发挥重要作用。经颅直流电刺激(tDCS)是一种无创的脑刺激形式。本研究探索tDCS是否能通过降低内异症疼痛大鼠炎症小体NLRP3的激活从而缓解中枢敏化性疼痛。
方法:经行为学评估后筛选出的28只疼痛组大鼠随机分为两组，14只实验研究组给予经头颅直流电刺激(tDCS)治疗，14只对照组予假治疗。通过静息态功能磁共振成像系统(rs-fMRI)对两组大鼠进行全脑扫描，局部一致性(ReHo)分析异常脑区激活信号差异，透射电镜进一步观察治疗与假治疗大鼠异常激活信号的脑区神经细胞超微结构变化;通过免疫组化检测两组大鼠内膜、局部病灶及异常激活信号脑区的雌激素水平、炎症小体相关蛋白的差异。通过两独立样本t检验分析两组大鼠行为学、影像学及组织形态学的指标，以P＜O.05差异有统计学意义。
结果:行为学热板实验结果显示两组治疗前的疼痛阈值分别为10.86±0.71秒和11.32±0.78秒，疼痛阈值差异无统计学差异，tDCS治疗后，假治疗对照组的疼痛阈值为11.64±0.80秒，tDCS治疗组的疼痛阈值为27.07±1.66秒，差异有统计学意义，认为tDCS治疗组大鼠的疼痛敏化程度有所缓解。rs-fMRI结果显示，与假治疗对照组的子宫内膜异位症疼痛大鼠组相比，tDCS治疗组大鼠的ReHo信号在前扣带回皮质区(左)、海马CA1区(左)、丘脑(左)、初级运动皮质(右)区域有所减弱。透射电镜进一步观察ReHo信号减弱的脑区，发现内异症疼痛假治疗组大鼠的神经元数量相对增多，胞内线粒体体积代偿性增大，甚至个别出现肿胀，而tDCS治疗组的线粒体可逆性恢复到正常大小。子宫内膜异位症疼痛假治疗对照组的髓鞘板层结构排列松散，甚至可见板层脱离，形态改变，tDCS治疗组的髓鞘板层结构排列紧密整齐。免疫组化结果发现，雌激素受体(ER)在正常内膜、两组的在位内膜和异位囊肿上皮均呈阳性表达。caspase-1、NLRP3及IL-1β在正常参照的子宫内膜表达呈阴性，在两组的子宫内膜表达呈阳性，在子宫内膜异位症疼痛假治疗对照组的异位囊肿组织中表达呈阳性，在tDCS治疗组的异位囊肿组织中表达呈相对弱阳性或阴性。Caspase-1、IL-1β和NLRP3在子宫内膜异位症疼痛假治疗组的海马区神经元细胞中表达呈阳性，在tDCS治疗组的神经元细胞中表达大部分呈阴性，H-score差异有统计学意义。
结论:本实验通过主观指标行为学及客观指标影像学、组织形态学同时验证，发现经颅直流电刺激局部脑区可通可降低炎症小体NLRP3的激活，减少IL-1β的释放，促进神经功能的恢复，从而缓解子宫内膜异位症的中枢敏化性疼痛。
目的:子宫内膜异位症(Endometriosis，EM，以下简称内异症)是育龄期女性常见的妇科疾病。疼痛、不孕和盆腔包块是其主要的临床表现和体征，约80％的内异症患者遭受不同程度的疼痛，其疼痛的原因主要是中枢敏化。本研究通过不同部位的内异症大鼠模型进行了高位中枢的脑功能活动分析，探索中枢敏化机制在不同部位子宫内膜异位模型间的差异。
方法:20只Sprague-Dawley雌性大鼠进行不同部位的内异症造模，分别为腹腔5只，腓肠肌组5只，卵巢组5只，假手术对照组5只。行为学评估不同部位内异症大鼠模型的疼痛敏化情况，随后对所有大鼠进行脑部功能核磁检测，局部一致性(regional homogeneity，ReHo)方法分析大脑中枢功能活跃区域的相关脑功能活动信号，找到异常功能激活区域。尼氏染色观察异常激活区域神经细胞的形态变化。
结果:通过行为学疼痛测试评估，发现腹腔EM组、腓肠肌EM组的疼痛敏感性高于卵巢EM组和对照组，卵巢EM组和对照组疼痛敏感性无差异。功能核磁检测分析得出在右侧丘脑及左侧嗅结节腓肠肌EM组的ReHo值低于其它三组。在右侧丘脑，腓肠肌EM组的尼氏小体染色加深，神经元数量较其他三组减少。在左侧嗅结节，四组的神经细胞数量及形态变化无差异(P＞0.05)。
结论:丘脑可能是不同部位内异症相关性疼痛中枢敏化机制的重要激活脑区。腓肠肌EM组的大鼠模型在丘脑区激活信号减弱，疼痛敏化增强。此发现可能为后续的不同部位内异症疼痛的影像学和病理学研究提供实验数据参考。
第二部分子宫内膜异位症疼痛大鼠模型异常激活脑区的分子机制探讨
目的:子宫内膜异位症是育龄期妇女常见病，70-80％的患者有不同类型的疼痛。目前与该疾病相关性疼痛的机制尚不清楚，中枢敏化可能是导致长期疼痛或疼痛反复的原因，但大多数关于子宫内膜异位症疼痛的研究目前都停留于行为或形态的观察，并没有提供足够的分子机制证据。因此本研究的目的是进一步了解大脑中枢敏化反应异常区域的变化，探索子宫内膜异位相关性疼痛中枢敏化的分子机制，从源头上解决问题，同时为临床治疗提供可靠的实验依据。
方法:40只Sprague-Dawley雌性大鼠进行子宫内膜异位症造模，行为学评估疼痛模型筛选出28只疼痛大鼠作为实验组，20只Sprague-Dawley大鼠行假手术为对照组，对所有大鼠进行全脑功能磁共振扫描，ReHo分析方法找到与中枢敏化有关的异常激活脑区，尼氏染色观察目标脑区的神经细胞状态，mRNA测序探索目标脑区差异基因的表达情况，实时定量PCR验证显著相关的差异基因表达，生物信息学方法分析与子宫内膜异位症疼痛中枢敏化发生机制的相关蛋白功能及蛋白通路，免疫组化染色观察关键蛋白TRPV1、NMDRA在该脑区的表达情况。
结果:行为学疼痛测试评估，疼痛组大鼠的疼痛阈值明显低于对照组，P＜0.001。fMRI扫描全脑，疼痛组的左侧前扣带皮层2区(Cg2)、左右侧丘脑(Tha)、海马CA1区、右侧脑干(BS)的ReHo信号较对照组明显增强，P＜0.005。尼氏染色发现ReHo信号增强的脑区如前扣带皮层、丘脑及海马，其尼氏小体染色加深，形态异常，周围可见凋亡的神经元;神经细胞核浓缩变形，核浆染色加深，凋亡细胞周围的神经元体积与对照组相比代偿性增大。mRNA测序结果发现三个目标脑区分别有139、101和66个基因异常表达，最显著的异常表达基因大都参与氧化还原反应所需的蛋白合成过程。GO和KEGG分析发现异常调节的差异基因主要参与了钙信号通路、轴突导向、局灶黏附和PI3K-Akt信号通路过程，通过免疫组化检测，其中的关键蛋白TRPV1和NMDAR在目标脑区表达呈强阳性。
结论:子宫内膜异位症疼痛中枢敏化的关键脑区可能发生在前扣带皮质、海马和丘脑。相关脑区的血氧平衡主要通过神经细胞和突触的可塑性参与调节。其分子机制可能涉及差异表达基因调控相应蛋白参与的PI3K/Akt信号通路、钙离子介导的瞬时受体电位通道蛋白通路和局灶黏附激酶等通路介导的突触可塑性调节机制。
第三部分通过tDCS降低内异症疼痛大鼠炎症小体NLRP3的激活缓解中枢敏化性疼痛
目的:疼痛、月经异常和不孕仍是子宫内膜异位症的主要症状。而疼痛症状在青春期和成年女性患者中高达70％-80％。疼痛的发生机制尚不清楚，可能与异位病灶种植后机体在局部产生炎症和疼痛介质，导致局部相关神经功能障碍，进而引起中枢敏化有关。雌孕激素受体表达的平衡受子宫内膜异位症局部炎症介导的炎症小体通路调节。NLRP3炎症小体在子宫内膜异位症疼痛的发生发展中发挥重要作用。经颅直流电刺激(tDCS)是一种无创的脑刺激形式。本研究探索tDCS是否能通过降低内异症疼痛大鼠炎症小体NLRP3的激活从而缓解中枢敏化性疼痛。
方法:经行为学评估后筛选出的28只疼痛组大鼠随机分为两组，14只实验研究组给予经头颅直流电刺激(tDCS)治疗，14只对照组予假治疗。通过静息态功能磁共振成像系统(rs-fMRI)对两组大鼠进行全脑扫描，局部一致性(ReHo)分析异常脑区激活信号差异，透射电镜进一步观察治疗与假治疗大鼠异常激活信号的脑区神经细胞超微结构变化;通过免疫组化检测两组大鼠内膜、局部病灶及异常激活信号脑区的雌激素水平、炎症小体相关蛋白的差异。通过两独立样本t检验分析两组大鼠行为学、影像学及组织形态学的指标，以P＜O.05差异有统计学意义。
结果:行为学热板实验结果显示两组治疗前的疼痛阈值分别为10.86±0.71秒和11.32±0.78秒，疼痛阈值差异无统计学差异，tDCS治疗后，假治疗对照组的疼痛阈值为11.64±0.80秒，tDCS治疗组的疼痛阈值为27.07±1.66秒，差异有统计学意义，认为tDCS治疗组大鼠的疼痛敏化程度有所缓解。rs-fMRI结果显示，与假治疗对照组的子宫内膜异位症疼痛大鼠组相比，tDCS治疗组大鼠的ReHo信号在前扣带回皮质区(左)、海马CA1区(左)、丘脑(左)、初级运动皮质(右)区域有所减弱。透射电镜进一步观察ReHo信号减弱的脑区，发现内异症疼痛假治疗组大鼠的神经元数量相对增多，胞内线粒体体积代偿性增大，甚至个别出现肿胀，而tDCS治疗组的线粒体可逆性恢复到正常大小。子宫内膜异位症疼痛假治疗对照组的髓鞘板层结构排列松散，甚至可见板层脱离，形态改变，tDCS治疗组的髓鞘板层结构排列紧密整齐。免疫组化结果发现，雌激素受体(ER)在正常内膜、两组的在位内膜和异位囊肿上皮均呈阳性表达。caspase-1、NLRP3及IL-1β在正常参照的子宫内膜表达呈阴性，在两组的子宫内膜表达呈阳性，在子宫内膜异位症疼痛假治疗对照组的异位囊肿组织中表达呈阳性，在tDCS治疗组的异位囊肿组织中表达呈相对弱阳性或阴性。Caspase-1、IL-1β和NLRP3在子宫内膜异位症疼痛假治疗组的海马区神经元细胞中表达呈阳性，在tDCS治疗组的神经元细胞中表达大部分呈阴性，H-score差异有统计学意义。
结论:本实验通过主观指标行为学及客观指标影像学、组织形态学同时验证，发现经颅直流电刺激局部脑区可通可降低炎症小体NLRP3的激活，减少IL-1β的释放，促进神经功能的恢复，从而缓解子宫内膜异位症的中枢敏化性疼痛。