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酵母提前絮凝(premature yeast flocculation,PYF)一直是一个长期困扰啤酒酿造行业发展的难题,因其复杂多样的影响因素及诸如PYF发生机理及PYF因子物质本质不确定等问题困扰,对啤酒酿造产生一系列不利影响,制约着啤酒行业的发展,并对麦芽制造企业及啤酒酿造企业造成严重的经济损失。近年来,随着自然环境污染及各种恶劣天气的出现,啤酒酵母提前絮凝的发生日渐频繁。本文通过深入研究大麦麦芽来源的PYF因子,揭示PYF因子物质特性及形成的主要机制,并对PYF的改善和控制提出可行性策略,为解决啤酒麦芽加工生产存在的PYF难题,提供理论指导意义和实践生产指导方法。论文主要研究过程及结果如下:(1)通过对收集到的19种麦芽进行PYF倾向性的检测,发现不同品种的麦芽均具有PYF倾向性;同一品种麦芽来自不同制麦厂,其PYF值有较大差异;来自同一制麦厂的同一品种麦芽,分属不同年份,其PYF值也有显著差异。制麦厂制麦工艺、啤酒大麦原料的生长或生产年份等,是影响成品麦芽PYF的主要宏观因素。(2)通过比较发酵过程的悬浮酵母细胞数,发酵结束时发酵残糖、酒精含量,筛选到4个PYF阳性(PYF+)麦芽(编号为PYF+1,PYF+3,PYF+5,PYF+6),选择该PYF+麦芽与PYF阴性(PYF-)麦芽进行皮壳互换实验。PYF+1皮壳分离后导致原有的PYF不再发生,说明麦芽中的PYF因子随皮壳的分离而分离;而PYF+3,PYF+5,PYF+6分别与PYF-麦芽皮壳互换后,均会发生PYF,说明PYF因子不仅存在于麦芽的皮壳部分,还存在于麦芽非皮壳部分。通过分析两部分来源PYF因子的物质特性,发现不同分子量大小的多糖均可引起PYF发生,PYF因子与阿拉伯木聚糖侧链的分支程度相关。(3)筛选获得同一制麦工艺同品种大麦制备的PYF+和PYF-麦芽,研究发现PYF+麦汁含有较高的结合态阿魏酸(Ferulic Acid,FA)。通过乙醇分级沉淀PYF+和PYF-麦芽协定麦汁中的多糖,比较各沉淀部分导致PYF的能力,发现麦芽中的PYF因子主要与乙醇40%(v/v)沉淀的多糖有关,且随着多糖含量的增加,导致PYF越严重。PYF+麦汁经40%乙醇沉淀FA含量显著高于PYF-麦汁同浓度乙醇沉淀,且FA/AX值也显著高于PYF-麦汁组分。能够导致PYF发生的阿拉伯木聚糖分子量在20~27 kDa之间,单糖组成显示PYF+麦汁乙醇40%沉淀组分中阿拉伯木聚糖侧链分支程度显著高于PYF-麦汁。(4)来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的阿拉伯木聚糖酶作用PYF-麦芽皮壳,会导致严重的PYF发生,且随着酶作用活力的升高,导致PYF越明显;来自黑曲霉(Aspergillus niger)的阿拉伯木聚糖酶作用PYF-麦芽皮壳,也会导致PYF发生,而随着酶作用活力的升高,导致PYF的作用不再显著,且两种酶作用后,均可显著增加麦汁中40%乙醇沉淀组分结合态FA含量、FA/AX比值升高。糖化初始添加Bacillus subtilis阿拉伯木聚糖酶导致PYF的作用明显,而添加Aspergillus niger阿拉伯木聚糖酶,导致PYF的作用不明显。Bacillus subtilis阿拉伯木聚糖酶的添加显著增加了麦汁中AX的含量,且当酶量添加至500 U·50 g-1麦芽时麦汁中结合态FA含量急剧升高;真菌阿拉伯木聚糖酶的添加,对麦汁中AX含量的影响较小,加酶后,麦汁中FA含量变化不明显。(5)高通量测序发现PYF+麦芽样品中的细菌和真菌微生物群落多样性均大于PYF-麦芽,在微生物目、科、属、种分类水平上均高于PYF-麦芽。在PYF+样品中,有14个细菌菌种、6个真菌菌种;在PYF-样品中,有11个细菌菌种、6个真菌菌种与NCBI基因数据库中含有木聚糖酶基因的种属对应。PYF+麦芽中产木聚糖酶的微生物种属主要是假单胞菌属(Pseudomonas geniculata、Pseudomonas sp.S1、Pseudomonas anguilliseptica),乳杆菌属(Lactobacillus sakei、Lactobacillus mali),金黄杆菌属(Chryseobacterium hispanicum、Chryseobacterium hominis),黄杆菌属(Flavobacterium sp.),核腔菌属(Pyrenophora Chaetomium、Pyrenophora teres)和曲霉属(Aspergillus niger)。对于PYF+麦芽样品来说,与麦芽PYF相关的主要微生物是Lactobacillus sakei、Lactobacillus mali、Flavobacterium sp.和Aspergillus niger。(6)比较获得PYF+和PYF-麦芽碱性差异蛋白点21个,共鉴定出8个斑点。其中,PYF-麦芽中检测到2个斑点为内切几丁质酶(26 kDa endochitinase 1),含量显著高于PYF+,同属于病程相关蛋白。另通过对不同麦芽中几丁质酶活力的测定,发现PYF+麦芽相比PYF-麦芽含有较低的几丁质酶活力。(7)构建了大麦木聚糖酶抑制剂(Hordeum vulgare L.xylanase inhibitor,HVXI)基因的表达载体,将其转化到毕赤酵母X33中克隆表达并分离纯化。将重组蛋白rHVXI在PYF+麦芽糖化初始加入,可以改善阳性麦芽的PYF倾向;重组蛋白rHVXI可以抑制阿拉伯木聚糖酶对阿拉伯木聚糖的水解作用,从而减弱PYF的发生。