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肠道内环境稳态是保持人体健康的前提,而肠粘膜屏障则是维持肠道内环境稳态的重要基石,其功能异常会严重影响肠道健康。酪蛋白磷酸肽是一类具有增强机体免疫力、促进矿物质吸收作用的乳源活性肽。早期研究发现,酪蛋白磷酸肽通过影响肠上皮细胞对钙的转运能力使细胞外钙浓度发生变化,进而促进小肠对钙的吸收。但是,对于酪蛋白磷酸肽是否能够通过影响小肠上皮细胞的增殖分化过程进而影响肠粘膜屏障功能还尚未可知。目前研究发现,钙敏感受体（CaSR）是感受细胞外钙离子浓度的特异性受体,在小肠上皮细胞中广泛存在,且能够通过影响紧密连接表达,在维持肠道通透性方面发挥作用。因此,本研究在建立猪小肠类器官模型的基础上,筛选出对小肠类器官增殖分化具有促进作用的酪蛋白磷酸肽SIER1P;以DSS诱导粘膜屏障功能损伤的猪小肠类器官2D培养物为模型,进一步研究了SIER1P对其粘膜屏障功能的保护作用,并基于CaSR探究了SIER1P影响肠粘膜屏障功能的机制,主要研究结果如下:猪小肠类器官3D培养条件的优化结果表明,8 mM EDTA分离猪小肠隐窝获得的隐窝数量多且形态完整,培养原代猪小肠类器官约7天可传代;传代比例为1:8时,所获得的猪小肠原代类器官形成率可达69%,二代类器官形成率可达90%,具有正常增殖能力且多样化的肠上皮细胞类型等特性。为适应开展后续研究,进行了猪小肠类器官2D培养条件的研究。结果显示,采用Matrigel铺胶法,按照Matrigel:PBS比例为1:20将类器官单细胞悬液培养3天后,可汇合形成具有紧密连接结构的2D单层培养物,以紧密连接蛋白蛋白ZO-1表达为主要特征;采用Transwell法,将单细胞悬液接入嵌套膜中培养3天后可观察到紧密连接和肠绒毛结构。由于Matrigel铺胶法建立2D单层简便,因此后续相关的研究采用此方法建立小肠类器官的2D单层模型。四种酪蛋白磷酸肽对猪小肠类器官生长影响的研究结果表明,5μg/mL的酪蛋白磷酸肽SIER1P能够促进猪小肠类器官的增殖和分化。采用100μg/mL葡聚糖硫酸钠（DSS）处理猪小肠类器官12h的方法建立了以炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β的分泌水平显著增加（p＜0.05）,紧密连接蛋白occludin、claudin-1、ZO-1 mRNA表达量显著降低（p＜0.05）为特征的猪小肠类器官黏膜屏障损伤模型。利用该模型的研究结果表明,5μg/mL的酪蛋白磷酸肽SIER1P能够显著缓解DSS诱导的炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平升高以及紧密连接蛋白occludin、claudin-1、ZO-1表达水平降低（p＜0.05）,改善DSS对小肠类器官黏膜屏障的损伤。SIER1P改善肠粘膜屏障损伤的机制的研究结果表明,SIER1P能够显著缓解DSS诱导的猪小肠类器官CaSR表达水平的升高。CaSR激活剂Spermine和抑制剂NPS2143的对比研究揭示CaSR介导了SIER1P对小肠类器官屏障功能的保护作用;对NF-κB信号转导通路的研究结果显示,PI3K和PLC均参与了SIER1P对炎性因子表达水平的调控,SIER1P可能通过CaSR/PI3K/NF-κB和CaSR/PLC/NF-κB两种信号通路同时发挥作用,实现了对DSS诱导的猪小肠类器官屏障炎性损伤的保护。综上所述,本研究筛选出对猪小肠类器官生长有促进作用的酪蛋白磷酸肽SIER1P,可通过增加紧密连接蛋白表达、降低炎性因子的分泌缓解由DSS诱导的猪小肠粘膜屏障损伤,CaSR介导的CaSR/PI3K/NF-κB和CaSR/PLC/NF-κB两个信号通路同时参与了酪蛋白磷酸肽SIER1P对肠粘膜屏障的保护作用。